本文選題：α-synuclein　切入點：星形膠質(zhì)細胞　出處：《中南大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的：研究過表達α-synuclein野生型和突變型(A53T、A30P)對星形膠質(zhì)細胞(astrocyte, AST)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基系統(tǒng)及細胞凋亡的影響。 方法：分離培養(yǎng)和純化新生1-3天SD大鼠皮質(zhì)區(qū)的AST,用免疫熒光的方法對其進行鑒定(GFAP), Western blot檢測AST內(nèi)源性α-synuclein的表達。用293FT細胞對前期已經(jīng)構(gòu)建好的(WT、A30P、 A53T)α-synuclein-HA-FUIGW-GFP、GFP-fuigw質(zhì)粒進行慢病毒包裝,收獲病毒上清后分別感染AST,分為過表達野生型組(WT組)、A30P組、A53T組和對照組(FUIGW組)。5-7天后免疫熒光及Western blot檢測AST中(WT、A30P、A53T) α-synuclein-HA融合蛋白的表達。衣霉素處理AST6小時作為陽性對照組,Western blot檢測各組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激指標蛋白BIP、CHOP的變化；免疫熒光檢測各組GM130觀察高爾基體形態(tài)的變化；流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率的變化。 結(jié)果：1)星形膠質(zhì)細胞有內(nèi)源性α-synuclein的表達。 2)慢病毒感染AST5-7天后免疫熒光及Western blot可檢測到過表達野生型組(WT組)、A30P組、A53T組α-synuclein-HA融合蛋白的表達,而FUIGW組未檢測至α-ynuclein-HA融合蛋白的表達。 3)過表達野生型組(WT組)、A30P組、A53T組BIP、CHOP指標明顯高于對照組(FUIGW組)(P0.05)；過表達野生型組(WT組)與A30P組、A53T組相比BIP、CHOP表達無顯著性差異(P0.05)。 4)過表達野生型組(WT組)與A30P組、A53T組的高爾基體分散在細胞質(zhì)中,囊泡碎裂；對照組(FUIGW組)高爾基體分布在細胞核一側(cè),囊泡完整無碎裂。經(jīng)χ2檢驗,過表達野生型組(WT組)、A30P組、A53T組的高爾基體碎裂百分比明顯高于對照組(FUIGW組)(P0.01)；過表達野生型組(WT組)與A30P組、A53T組的高爾基體碎百分比差異無顯著性(P0.05)。 5)過表達野生型組(WT組)、A30P組、A53T組的AST凋亡率明顯高于對照組(FUIGW組)(P0.01)；過表達野生型組(WT組)與A30P組、A53T組的AST凋亡率差異無顯著性(P0.05)。 結(jié)論： 過表達a-synuclein野生型和突變型(A53T、A30P)可能通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體系統(tǒng)損傷誘導星形膠質(zhì)細胞的凋亡。
[Abstract]:Aim: to study the effects of overexpression of 偽 -synuclein wild type and mutant A53TnA30P on the endoplasmic reticulum Golgi system and apoptosis of astrocyte astrocyte (AST). Methods: AST3 was isolated and purified from the cortex of neonatal Sprague-Dawley rats (1-3 days), and identified by immunofluorescence. The expression of AST endogenous 偽 -synuclein was detected by Western blot. The previously constructed plasmids were packaged using 293FT cells for the slow virus packaging of the previously constructed plasmids, named as WTA30P, A53T) 偽 -synuclein-HA-FIGW-GFPFPGFP-fuigw, and the expression of 偽 -synuclein-HIGW-GFPGFP-fuigw plasmid was detected by Western blot. The virus supernatants were infected with ASTand were divided into two groups: overexpression wild-type group and control group FUIGW group. Immunofluorescence and Western blot were used to detect the expression of 偽 -synuclein-HA fusion protein in AST after treatment with AST6 for hours. The changes of endoplasmic reticulum stress index protein (BIP-CHOP) were detected by Western blot. The changes of Golgi body morphology and apoptosis rate were detected by immunofluorescence and flow cytometry respectively. Results: 1) Endogenous 偽-synuclein was expressed in astrocytes. 2) the expression of 偽 -synuclein-HA fusion protein was detected by immunofluorescence and Western blot on day after lentivirus infection in wild type AST5-7 group, while the expression of 偽 -ynuclein-HA fusion protein was not detected in FUIGW group. (3) the expression of BIP-CHOP in wild type group was significantly higher than that in control group (P 0.05), and that in wild type group was not significantly different from that in group A30P group (P 0.05), and that in wild type group was higher than that in group A30P group (P < 0.05). 4) the Golgi body of the over-expressed wild type group (WT group) and A30P group (A53T group) were dispersed in the cytoplasm, and the vesicles of the control group (FUIGW group) were scattered in the cytoplasm. The percentage of Golgi body fragmentation in the over-expressed wild type group was significantly higher than that in the control group (FUIGW group) and the wild type group (WT group), and there was no significant difference in the percentage of Golgi body fragmentation between the over-expressed wild type group and the A30P group (P 0.05). 5) the apoptosis rate of AST in the wild type group was significantly higher than that in the control group (P 0.01), and there was no significant difference in the apoptosis rate of AST between the wild type group and the A30P group (P 0.05). Conclusion:. Overexpression of a-synuclein wild-type and mutant A53TnA30Pmay induce apoptosis of astrocytes through endoplasmic reticular-Golgi system injury.
【學位授予單位】：中南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R742.5

【共引文獻】

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本文編號：1571499