本文選題：腦出血　切入點：NF-κB　出處：《山東大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景與目的 腦出血是神經(jīng)科常見的急癥,病死率及致殘率高,40%的存活者遺留嚴重殘疾,是威脅中老年人健康的主要疾病之一,并且在近些年發(fā)病呈年輕化趨勢。目前,尚缺乏有效的手段治療腦出血導致的神經(jīng)功能缺損。 國內(nèi)外研究表明在大鼠腦出血模型中,血腫周圍存在大量炎性細胞浸潤,炎性反應是腦出血繼發(fā)性神經(jīng)損傷的重要機制,NF-κB在腦出血炎性反應中起中心調(diào)控作用,多種炎性因子如TNF-α、IL-1β等均為其下游因子,與中樞神經(jīng)免疫細胞即小膠質(zhì)細胞的增生以及神經(jīng)細胞凋亡關系密切。另有動物模型實驗表明,可通過干預NF-κB活化的方法來減少神經(jīng)細胞的凋亡。但目前對腦出血患者血腫周圍組織的炎性因子表達以及其與神經(jīng)細胞凋亡關系的深入研究甚少。因此,本研究收集了山東大學齊魯醫(yī)院急診外科基底節(jié)區(qū)腦出血患者53例,對其臨床資料及血腫周圍的腦組織進行研究,分析NF-κB和其介導的炎性因子IL-1β、TNF-α的表達規(guī)律及其與細胞凋亡的關系,為今后是否可通過干預NF-κB表達的方法治療人類腦出血,改善患者預后提供理論依據(jù)。 資料與方法 1、臨床資料與分組：選取山東大學齊魯醫(yī)院急診外科2010年11月至2012年11月收治的基底節(jié)區(qū)腦出血患者53例為實驗組,入組要求為血腫量40m1-80ml,并且開顱沿無功能區(qū)行腦皮層造瘺血腫清除手術的患者。其中男33例,占62.26%,女20例,占37.74%；年齡30-70歲,平均56.7歲；術前GCS評分4-14分,其中13-14分6例,9-12分32例,4-8分15例。根據(jù)發(fā)病及標本采集時間分為6組,其中A組8例：≤6小時,B組14例：7-12小時,C組12例：13-24小時,D組8例：25-48小時,E組6例：49-96小時,F組5例：96小時。 選取經(jīng)皮層造瘺行腦室手術治療良性病變的患者8例為對照組(Ctrl),其中男5例,女3例；年齡30-69歲,平均年齡54.3歲。 所收集腦組織均為正常手術過程中丟棄的廢棄腦組織,所有病例均已術前征得患者家屬的書面知情同意及醫(yī)院倫理委員會的書面同意。共同排除標準：排除有引起待檢測因子變化的其他因素：1月內(nèi)存在出血、炎癥、創(chuàng)傷、手術等情況,存在全身某個器官或系統(tǒng)的基礎疾病或其他腫瘤,1月內(nèi)應用影響免疫系統(tǒng)的藥物等。 2、標本采集：實驗組取皮層造瘺通道血腫周圍1cm處的腦組織塊,對照組取皮層造瘺通道灰白質(zhì)交界處的腦組織塊,取下后分為2部分,其一迅速用10%福爾馬林固定,待行HE染色,免疫組織化學檢測,以及細胞凋亡檢測；其二迅速放入液氮罐并于半小時內(nèi)轉(zhuǎn)移至-80℃冰箱內(nèi),待行逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(Reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)及Western Blot檢測。 3、mRNA水平檢測：提取腦組織總RNA,應用RT-PCR方法測定NF-κB p65、 IL-1β、TNF-α mRNA的表達水平。所用引物序列：人NF-κB p65(321bp):F:5'-TGCTGTGCGGCTCTGCTTCC-3', R:5'-AGGCTGGGGTCTGCGTAGGG-3';人IL-1β(442bp):F:5'-ATAAGCCCACTCTACAGCT-3', R:5'-ATTGGCC CTGAAAGGAGAGA-3';人TNF-α (325bp):F:5'-CAGAGGGAAGAGTTC CCCAG-3', R:5'-CCTTGGTCTGGTAGGAGACG-3';人β-actin (539bp):F:5'-GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3', R:5'-CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。 4、蛋白水平檢測：應用核蛋白-胞漿蛋白抽提試劑盒(Thermo Fisher Scientific Inc.,美國)分離核蛋白及胞漿蛋白,分別應用HSP90和HDAC-1作為漿蛋白和核蛋白的內(nèi)參,檢測提取純度,結果示提取純度高。每份樣本提取核蛋白,Western Blot方法檢測細胞核中NF-κB p65的表達水平,以此判斷活化入核的NF-κB水平；提取胞漿蛋白,Western Blot方法檢測IL-1β、TNF-α的表達水平。所用一抗：NF-κB p65抗體(B7162兔多抗,ANBO,美國),IL-1p抗體(AP8531c兔多抗,ABGENT,美國),TNF-α抗體(ab9579鼠單抗,abcam,美國)；二抗：辣根酶標記的山羊抗兔IgG (Jackson ImmunoResearch,美國),辣根酶標記的山羊抗小鼠IgG (Jackson ImmunoResearch,美國)；蛋白濃度應用微量BCA蛋白測定試劑盒測定(Thermo Fisher Scientific Inc.,美國)。 5、免疫組織化學檢測：常規(guī)石蠟切片行HE染色,然后根據(jù)二步法免疫組化試劑盒要求操作。在普通顯微鏡下觀測結果,400×高倍鏡下隨機選取5個無重復視野,統(tǒng)計細胞核NF-κB p65表達陽性及細胞漿IL-1β、TNF-α表達陽性的細胞數(shù),結果以5個視野陽性細胞總數(shù)表示。所用一抗：同Western Blot;二抗：非生物素兔超敏二步法二抗(PV-9001, GBI公司,美國),非生物素小鼠超敏二步法二抗(PV-9002,GBI公司,美國)。 6、細胞凋亡檢測:采用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導的dUTP缺口末端標記測定法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling, TUNEL法),根據(jù)試劑盒(Roche公司,德國)要求操作,熒光顯微鏡(Olympus BX51)下及DAB顯色后普通顯微鏡下觀測結果,400×高倍顯微鏡下隨機選取5個無重復視野,統(tǒng)計凋亡細胞數(shù),結果以5個視野陽性細胞總數(shù)表示。 7、統(tǒng)計方法：病理切片采用DP70數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)及圖像處理軟件(DPController, DP Manager)采集分析。應用SPSS19.0統(tǒng)計學分析軟件及Excel2003軟件行統(tǒng)計學分析及圖表制作,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示,兩組間均數(shù)比較采用T檢驗,兩變量之間的相關分析采用皮爾遜相關系數(shù)(Pearson's correlation coefficient)分析,P0.05被認為有統(tǒng)計學意義。 結果 1、腦出血血腫周圍腦組織中NF-κB介導的炎性因子表達水平及時間變化規(guī)律 (1) NF-κB p65、IL-1β、TNF-α mRNA水平的表達及時間變化規(guī)律 NF-κB p65、IL-1β、TNF-α mRNA水平的表達在各實驗組均與對照組存在顯著性差異(P0.001)。NF-κB p65mRNA在腦出血后表達水平逐漸升高,在13-24小時組表達水平最高,其與7-12小時及25-48小時組相比未見顯著性差異(PB/C、PC/D0.05),與其余各時間組相比均存在顯著性差異(PA/C、PC/E0.001),提示7-48小時為其表達高峰時段；IL-1β mRNA在≤6小時組表達水平最高,其與7-12小時組相比未見顯著性差異(PA/B0.05),與其余各時間組相比均存在顯著性差異(PA/C0.05,PA/F0.001),提示12小時內(nèi)為其表達高峰時段；TNF-α mRNA在腦出血后表達水平逐漸升高,在7-12小時組表達水平最高,其與13-24小時組相比未見顯著性差異(PB/C0.05),與其余各時間組相比均存在顯著性差異(PA/B、PB/D、0.001),提示7-24小時為其表達高峰時段。 (2) Western Blot方法檢測IL-1β、TNF-α、核蛋白NF-κB p65的蛋白水平表達及時間變化規(guī)律 胞漿蛋白IL-1β、TNF-α以及核蛋白NF-κB p65的蛋白水平表達在各實驗組均與對照組存在顯著性差異(P0.001)。核蛋白中NF-κB p65在腦出血后表達水平逐漸升高,在25-48小時組表達水平最高,其與13-24小時組相比未見顯著性差異(PC/D0.05),與其余各時間組相比均存在顯著性差異(PB/D0.05,PA/D、 PD/E0.01),提示13-48小時為其表達高峰時段；胞漿蛋白中IL-1p在≤6小時組表達水平最高,其與7-12小時及13-24小時組相比均未見顯著性差異(PA/B、PA/C0.05),與其余各時間組相比均存在顯著性差異(PA/D、PA/E0.01),提示24小時內(nèi)為其表達高峰時段；胞漿蛋白中TNF-α在腦出血后表達水平逐漸升高,在13-24小時組表達水平最高,其與25-48小時組相比未見顯著性差異(PC/D0.05),與其余各時間組相比均存在顯著性差異(PA/C、PB/C0.05,PC/E0.005),提示13-48小時為其表達高峰時段。 (3)免疫組化方法檢測NF-κB p65、IL-1β、TNF-α的蛋白水平表達及時間變化規(guī)律 各實驗組免疫組化檢測顯示,NF-κB p65在神經(jīng)元細胞及膠質(zhì)細胞細胞核內(nèi)表達,提示NF-κB已被活化并轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi),各實驗組NF-κB p65細胞核表達陽性細胞數(shù)均與對照組存在顯著性差異(P0.001),腦出血后陽性細胞逐漸增多,在13-24小時組達到最多,其與25-48小時組相比未見顯著性差異(PC/D0.05),與其余各時間組相比均存在顯著性差異(PB/C0.05,PA/C、PC/E0.001),提示13-48小時為其表達高峰時段;IL-1p在神經(jīng)元細胞及膠質(zhì)細胞細胞漿中表達,各實驗組IL-1β表達陽性細胞數(shù)均與對照組存在顯著性差異(P0.001),實驗組中,≤6小時組陽性細胞最多,其與7-12小時及13-24小時組相比均未見顯著性差異(PA/B、PA/C0.05),與其余各時間組相比均存在顯著性差異(PA/D0.05,PA/W0.01),提示24小時內(nèi)為其表達高峰時段；TNF-α在神經(jīng)元細胞及膠質(zhì)細胞細胞漿中表達,各實驗組TNF-α表達陽性細胞數(shù)均與對照組存在顯著性差異(P0.001),腦出血后陽性細胞數(shù)逐漸增多,在25-48小時組最多,其與13-24小時組相比未見顯著性差異(PC/D0.05),與其余各時間組相比均存在顯著性差異(PB/D0.05,PA/D、PD/E0.01),提示13-48小時為其表達高峰時段。 2、TUNEL法檢測腦出血血腫周圍腦組織中細胞凋亡情況及時間變化規(guī)律 應用TUNEL法檢測腦出血血腫周圍腦組織細胞凋亡,熒光顯微鏡下及DAB顯色后普通顯微鏡下均可見大量TUNEL陽性細胞,神經(jīng)元細胞及膠質(zhì)細胞均存在凋亡情況；各實驗組凋亡細胞數(shù)均與對照組存在顯著性差異(P0.001),腦出血后凋亡細胞逐漸增多,在25-48小時組最多,其與13-24小時組相比未見顯著性差異(PC/D0.05),與其余各時間組相比均存在顯著性差異(PD/E0.05,PB/D、PD/F0.001),提示13-48小時為細胞凋亡高峰時段。 3、細胞凋亡與NF-κB活化、IL-1p及TNF-α的關系 細胞核NF-κB p65、細胞漿IL-1β及TNF-α蛋白水平的表達高峰時段別為13-48小時、24小時內(nèi)及13-48小時,Western Blot及免疫組化方法測定結果一致,TUNEL法測定細胞凋亡高峰時段為13-48小時,提示細胞凋亡與細胞核NF-κB p65的表達存在一致的變化規(guī)律。采用皮爾遜相關系數(shù)分析細胞核NF-κBp65表達陽性細胞數(shù)與凋亡細胞數(shù)的相關性,結果顯示兩者存在明顯的線性相關(P0.0001)。 結論 1、腦出血后血腫周圍腦組織中活化入核的NF-κB以及IL-1β、TNF-α的蛋白水平表達明顯增高,分別于13-48小時、24小時內(nèi)以及13-48小時到達高峰,細胞凋亡于13-48小時達到高峰,且與NF-κB的活化關系密切； 2、NF-κB的活化、IL-1β、TNF-α的表達以及細胞凋亡存在著與動物模型實驗相似的時間變化規(guī)律； 3、通過干預NF-κB活化的方法治療人類腦出血,減輕炎性反應,減少細胞凋亡,進而改善患者的預后是可行的。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R743.34

【參考文獻】

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本文編號：1561962