發(fā)布時間：2018-03-02 15:31

  本文選題：Notch2　切入點：膠質瘤　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：膠質瘤是最常見的中樞神經系統(tǒng)的惡性腫瘤,具有較強的侵襲性和進展性。目前臨床治療上采用的主要方法有手術切除、放療及化療的綜合療法,但由于膠質瘤的生長特性,與周圍腦組織界限不清,手術難以切除完全,而放療、化療由于膠質瘤對其耐受性等治療的局限性,療效有限,患者中位生存期較短,尤其對于高級別膠質瘤,治療后復發(fā)率較高,預后差,中位生存期不足一年,病死率高,嚴重威脅患者生命影響人類健康。研究其發(fā)病機制,尋找新的有效的治療方法是臨床研究的主要目標之一。細胞周期調控和細胞凋亡與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展過程密切相關,在膠質瘤發(fā)生和發(fā)展過程中,存在著很多信號傳導系統(tǒng),復雜而精細調控機體內環(huán)境的平衡,癌基因及抑癌基因對細胞周期及細胞凋亡通路調節(jié)的失控,信號通路傳導系統(tǒng)異常刺激腫瘤細胞增殖與進展,發(fā)生細胞癌變。在分子水平上的免疫治療和基因治療是近年來膠質瘤治療研究的新方向,通過抑制異常激活的信號傳導通路,調控細胞周期,是促進腫瘤細胞凋亡,抑制腫瘤細胞增殖的有效措施之一 Notch信號通路是在無脊椎動物和脊椎動物中普遍存在的,在進化上具有高度的保守性的信號傳導通路,在細胞增殖、分化、發(fā)育中具有重要的關鍵性作用。Notch信號通路與惡性腫瘤的關系已成為近年來的研究熱點之一,其與腫瘤通路有較多的相互作用,Notch受體和配體在多種腫瘤中表現為異常表達,與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關系密切。且在不同類型的腫瘤中,甚至在同一腫瘤的不同發(fā)展階段,Notch表達的作用也不盡相同,可表現為致癌性,也可表現為抑癌性。Notch受體包括Notchl-4種,研究顯示,每種受體在腫瘤中的生物學功能有所不同,甚至截然相反,因此,有必要對每種Notch受體分別進行研究。關于Notch信號與腫瘤生成的因果關系尚無定論,在腫瘤細胞中發(fā)現Notch信號通路異常,尋找到可能的靶點,通過體外試驗和動物實驗等方法,靶向研究Notch信號通路異常對腫瘤生成的影響,探討Notch信號通路和腫瘤生成的作用機制,以期對腫瘤診斷和治療提供新的思路和方法,是研究的常用模式。 RNA干擾技術是研究基因功能的有效手段,有利于迅速的發(fā)現藥物作用的有效靶點,并通過體外細胞培養(yǎng)等實驗技術來得以證實。短發(fā)夾狀RNA (shRNA)是設計為能夠形成發(fā)夾結構的非編碼小分子RNA,可被細胞核內自身基因表達序列表達,可以通過內源性的RNA干擾來抑制特定基因的表達,可使靶向基因長時間穩(wěn)定沉默。質粒載體是shRNA主要載體之一,能使目的shRNA穿過生理屏障,并在細胞核內完成自我復制發(fā)揮穩(wěn)定持久的干擾效果。以質粒構建shRNA并轉染細胞是腫瘤分子水平研究的重要手段之一。裸鼠是先天性胸腺缺陷的突變小鼠,是腫瘤學研究中常用的動物模型,其免疫缺失和便于觀察等特點,使其在腫瘤研究中被廣泛應用。 近年來研究發(fā)現Notch信號在人類腦膠質瘤中也發(fā)揮作用,但Notch信號在膠質瘤的發(fā)生和發(fā)展中的具體作用尚不明確。本實驗應用免疫組化方法對32例腦膠質瘤標本和20例腦組織標本進行Notch2蛋白的檢測,研究Notch2在人類腦膠質瘤中的表達及意義。并構建Notch2-shRNA干擾質粒對人膠質瘤細胞株U251進行轉染,建立穩(wěn)定轉染的細胞株,利用實時定量PCR、蛋白印跡法(western blot), MTT法及流式細胞術(FCM)等檢測各組細胞周期、細胞增殖和細胞凋亡情況。再以Notch2基因敲除的U251細胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型,觀察Notch2對體內腫瘤的生成和腫瘤生長的影響,為臨床腫瘤治療提供可靠的論依據。本實驗共分為3個部分。 第一部分Notch2蛋白在人腦膠質瘤組織中的表達及意義 目的：研究Notch2蛋白在人腦膠質瘤組織中的表達及臨床意義。 方法：選擇膠質瘤標本22例和正常腦組織標本20例為研究對象,采用免疫組化法檢測并比較其Notch2表達,并分析Notch2表達與膠質瘤病理分級的相關性。 結果：Notch2表達在膠質瘤組織中顯著高于正常腦組織中Notch2表達(P0.001)。在Ⅰ～Ⅱ級膠質瘤中Notch2的表達顯著低于Ⅲ～Ⅳ級膠質瘤中Notch2的表達(P0.01)。 結論：Notch2與膠質瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關,為膠質瘤的診斷和治療提供新的思路和理論依據。 第二部分Notch2-shRNA穩(wěn)定轉染對人腦膠質瘤細胞株U251增殖、凋亡和細胞周期的影響 目的：研究Notch2-shRNA穩(wěn)定轉染對人腦膠質瘤細胞株U251增殖、凋亡和細胞周期的影響。 方法：構建Notch2-shRNA干擾質粒及相同載體的無意義序列Negative-shRNA對人膠質瘤細胞株U251進行轉染,建立穩(wěn)定轉染的細胞株,分別作為Notch2-shRNA干擾組和Negative-shRNA干擾組,并以未轉染U251細胞作為未轉染對照組,利用實時定量PCR、蛋白印跡法(western blot)測定各組Notch2及相關蛋白的表達情況,采用MTT法觀察各組U251細胞生長情況,采用流式細胞術(FCM)檢測各組細胞周期和細胞凋亡情況。 結果：與Negative-shRNA干擾組和未轉染組相比,Notch2-shRNA干擾組細胞中Notch2蛋白及其活性片段NICD蛋白在Notch2-shRNA干擾組中表達顯著降低,cyclinD1和MCM2蛋白在Notch2-shRNA干擾組中的表達亦明顯降低,p21和p27蛋白的表達明顯升高。MTT生長曲線顯示,Notch2-shRNA干擾組細胞生長速度較Negative-shRNA干擾組和未轉染組更慢,尤其從第5天開始,Notch2-shRNA干擾組生長速度較其他兩組顯著降低(均P=0.0000.001)。Notch2-shRNA干擾組、Negative-shRNA組和未轉染組的U251細胞的凋亡率分別為(13.22±1.90)%、(2.62±0.26)%和(2.47±0.36)%,Notch2-shRNA干擾組顯著高于Negative-shRNA組和未轉染組,差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.003,P=0.003)。在G1期,Notch2-shRNA干擾組細胞百分比顯著高于Negative-shRNA干擾組和未轉染組(P=0.0000.001,P=0.0000.001,),在S期,Notch2-shRNA干擾組細胞百分比顯著低于Negative-shRNA干擾組和未轉染組(P=0.0000.001,P=0.0000.001,)。 結論：Notch2與膠質瘤U251細胞增殖、凋亡及細胞周期有關,抑制Notch2表達可抑制細胞增殖,誘導細胞凋亡,使細胞周期在G1/S期被阻滯,其作用的發(fā)揮可能是通過下調cyclinD1和MCM2蛋白的表達和上調p21和p27蛋白的表達實現的。 第三部分Notch2-shRNA穩(wěn)定轉染細胞株U251的裸鼠皮下移植研究 目的：研究Notch2蛋白抑制的人膠質瘤細胞株U251的致瘤性及對裸鼠生存時間的影響。 方法：以Notch2-shRNA及相同載體無意義序列Negative-shRNA穩(wěn)定轉染的U251細胞株、和未轉染的U251細胞株建立裸鼠皮下移植瘤模型,每組各10只,定期測量腫瘤大小,繪制腫瘤生長曲線；移植后60天每組隨機取4只裸鼠處死,稱量瘤重并計算腫瘤抑制率,免疫組化法檢測腫瘤中Notch2表達水平；對各組其余裸鼠記錄并比較其生存時間。 結果：Notch2-shRNA轉染組裸鼠腫瘤生長較Negative-shRNA轉染組和未轉染組更緩慢,腫瘤體積更小,至各組裸鼠接種第60d, Notch2-shRNA轉染組、Negative-shRNA轉染組和未轉染組的腫瘤大小分別為(2.72±0.21)mm2、(9.23±0.17)mm2和(9.91±0.77)mm2, Notch2-shRNA轉染組裸鼠腫瘤體積顯著小于Negative-shRNA轉染組和未轉染組,差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.0000.001,P=0.0000.001)。細胞接種60d后Notch2-shRNA轉染組、Negative-shRNA轉染組和未轉染組平均瘤重分別為(0.46±0.04)g、(1.32±0.03)g和(1.35±0.11)g,Notch2-shRNA轉染組瘤重顯著小于Negative-shRNA轉染組和未轉染組,差異均有統(tǒng)計學意義(P=0.0000.001,P=0.0000.001)。Notch2-shRNA轉染組抑瘤率為65.74%; Notch2-shRNA轉染組Notch2表達明顯小于Negative-shRNA轉染組和未轉染組(P0.01)。 Notch2-shRNA轉染組、Negative-shRNA轉染組和未轉染組裸鼠生存時間分別為(114.33±9.05)d、(70.83±10.50)d和(71.67±8.82)d, Notch2-shRNA轉染組裸鼠的生存時間顯著長于Negative-shRNA轉染組和未轉染組(P0.001)。 結論：抑制Notch2表達可顯著降低U251細胞的致瘤性,抑制膠質瘤生成和進展,為膠質瘤的基因治療提供理論依據。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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1 曾冉;況建國;;膠質瘤發(fā)病機制的研究進展[J];廣東醫(yī)學;2013年06期

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本文編號：1557101