本文關(guān)鍵詞： 膠質(zhì)瘤 血管生成擬態(tài) 膠質(zhì)纖維性蛋白 波形蛋白 預后　出處：《南方醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：一、研究背景 腦膠質(zhì)瘤是成年人中最常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤,盡管臨床上具備手術(shù)聯(lián)合放化療等全面綜合治療手段,膠質(zhì)母細胞瘤患者的中位生存期也僅為12-15月。其不容樂觀的臨床預后與膠質(zhì)瘤自身浸潤性生長的生物學特性有關(guān),而瘤組織中微血管異常增生、高度血管化畸形在腫瘤的侵襲性生長過程中起重要作用。因此,腫瘤血管生成的相關(guān)研究一直成為熱點。當前已在膠質(zhì)瘤中得到證實并較公認的血管生成方式包括：血管共同選定(vascular co-option)、成血管細胞募集(vasculogenesis)和出芽式血管生成(angiogenesis)。隨著研究不斷深入,近年來又發(fā)現(xiàn)了一種與經(jīng)典內(nèi)皮依賴性腫瘤血管生成途徑完全不同的血液供應方式—“血管生成擬態(tài)”(Vasculogenic mimicry, VM)。此概念于1999年由美國Iowas大學Maniotis和Folberg等根據(jù)對人眼葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)的研究而提出,主要描述的是高度侵襲性腫瘤細胞通過自身可塑性和基質(zhì)重構(gòu)產(chǎn)生具有微循環(huán)功能的類血管樣通道,通道內(nèi)無血管內(nèi)皮細胞襯覆,卻能滿足瘤組織血液供應。隨后,在多種非黑色素瘤惡性腫瘤組織中,如乳腺癌、滑膜肉瘤、橫紋肌肉瘤、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤等,都相繼報道了血管生成擬態(tài)。 2005年,Yue和Chen等人在45例星形細胞瘤患者中證實有2例標本存在血管生成擬態(tài)現(xiàn)象。他們利用CD34/PAS雙重染色法對膠質(zhì)瘤標本進行處理,發(fā)現(xiàn)某些標本中存在PAS陽性CD34陰性的網(wǎng)絡狀結(jié)構(gòu)相互連結(jié)形成半閉合或完全閉合的環(huán),中空的環(huán)狀結(jié)構(gòu)里面發(fā)現(xiàn)有紅細胞和血漿。這些現(xiàn)象與Folberg等人提出的圖案樣基質(zhì)型血管生成擬態(tài)描述完全一致。E1Hallani等在2010年使用CD34/PAS雙重染色法觀察膠質(zhì)母細胞瘤中的微血管,也發(fā)現(xiàn)了一種與CD34+的內(nèi)皮細胞依賴性血管不同的管道型血管。這種管道可見紅細胞存在,但是其管道壁上襯覆的是CD34-的細胞。為了明確該管道的性質(zhì),研究者對病理組織標本進行連續(xù)切片的免疫組織化學染色觀察,發(fā)現(xiàn)CD34+細胞構(gòu)成的管道和CD34"細胞排列形成細胞的管道之間存在相連接的區(qū)域,并進一步證實了這種管道樣血管實質(zhì)上是內(nèi)皮依賴性血管的延續(xù)。Shaifer等人提出膠質(zhì)母細胞瘤(GBMs)中的VM存在與腫瘤的放療抵抗有關(guān)。他們在三維器官型培養(yǎng)基上共同培養(yǎng)GFP轉(zhuǎn)染的膠質(zhì)瘤細胞和紅色活性染料標記的內(nèi)皮細胞,發(fā)現(xiàn)首先是內(nèi)皮細胞形成血管結(jié)構(gòu),接著膠質(zhì)瘤細胞在48小時內(nèi)整合加入形成馬賽克血管網(wǎng)絡。在血管生成的條件下,膠質(zhì)瘤細胞形成三維立體的血管網(wǎng)絡,但是這些膠質(zhì)瘤細胞始終未表達特異性內(nèi)皮細胞分子,表明該血管樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)就是血管生成擬態(tài)(VM)。Liu等人認為血管生成擬態(tài)(VM)是影響膠質(zhì)瘤患者預后的不良因素之一,同時有趣的發(fā)現(xiàn)瘤組織中的VM大多出現(xiàn)在微血管密度較低的區(qū)域,從而提出VM很可能是腫瘤新生血管的一種補充方式。該研究在探討VM陽性患者的不良預后是否由膠質(zhì)瘤WHO高級別所決定的時得出的結(jié)論卻是,膠質(zhì)母細胞瘤(WHOIV級)中是否存在血管生成擬態(tài)對其預后沒有影響。但該研究樣本量偏小,需要進一步研究來證實。 目前普遍認為,腫瘤細胞的可塑性(tumor cell plasticity)是VM形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié),其相關(guān)機制還尚未完全明確。腫瘤細胞模擬其他類型細胞的基因表達和生物學行為的特性被稱為“可塑性”,它是VM形成的分子基礎。腫瘤細胞的可塑性,與細胞生長、粘附和形態(tài)的改變密切相關(guān)。細胞形態(tài)學上的改變往往能反映細胞的生長特性與功能的改變。而細胞骨架(cytoskeleton)是決定細胞形態(tài)的主要物質(zhì)。正常情況下,細胞骨架與胞膜連接,與細胞外基質(zhì)進行跨膜反應,控制膜受體及微絲粘著斑的活性狀態(tài),進而調(diào)節(jié)細胞的黏附和運動；而骨架系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的變化可干擾信號傳導系統(tǒng)的工作,最終導致腫瘤細胞發(fā)生生物學性狀改變。因此考慮膠質(zhì)瘤細胞骨架結(jié)構(gòu)的重塑與血管生成擬態(tài)(VM)發(fā)生過程中腫瘤細胞可塑性的形成密切相關(guān)。然而,國內(nèi)外至今尚未見有關(guān)此方面報道。 二、研究目的及意義 本研究利用免疫組織化學和特殊組織化學結(jié)合的雙重染色技術(shù),觀察63例人腦膠質(zhì)瘤患者石蠟標本中血管生成擬態(tài)(VM)在膠質(zhì)瘤組織中的生成特點,分析VM與膠質(zhì)瘤患者的臨床病理因素、臨床預后轉(zhuǎn)歸的關(guān)系；并進一步檢測膠質(zhì)瘤組織中GFAP、Vimentin和Ki-67的表達,初步探討它們在VM形成中的作用。旨在尋找影響膠質(zhì)瘤患者預后的新指標,同時為抗腫瘤血管生成治療提供新的思路及可能的靶點。 三、實驗過程 1材料和方法 1.1臨床資料收集存檔于南方醫(yī)科大學珠江醫(yī)院病理科2008年1月-2011年12月期間診斷為腦膠質(zhì)瘤的石蠟標本63例。所選病例臨床病理資料完整,患者在術(shù)前均未接受過放療及化療。其中男40例,平均年齡55±25.5歲,女23例,平均年齡54±31歲。依據(jù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤WHO(2007)分級標準,包括WHOⅡ級17例,WHOⅢ級22例,WHOⅣ級24例。腫瘤大小以腫瘤切除的最大直徑計算。以電話的方式對入選患者進行隨訪,隨訪時間從手術(shù)當天開始到死亡時間或2012年12月截止,中位隨訪時間為55周。術(shù)后生存時間為8-271周,中位生存期為67±12.19周。術(shù)后2周之內(nèi)死亡不納入生存分析中,因為其死亡可能是手術(shù)的并發(fā)癥所致,不是疾病的自然進程。 1.2實驗試劑及方法采用免疫組織化學染色SP法,一抗分別為GFAP(即用型,兔抗人,編號ZA-0529)、Vimentin單克隆抗體(即用型,兔抗人,編號ZA-0511)、Ki-67(即用型,鼠抗人,7B11,ZM--0165)、CD34(即用型,鼠抗人,QBEnd/10,ZM--0046), SP試劑盒、DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物公司。CD34/PAS雙重染色方法,首先遵循免疫組化SP法進行GFAP、Vimentin、Ki-67和CD34染色,DAB顯色后,進行PAS復染(高碘酸溶液及雪夫試劑購自于珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。 2. CD34/PAS雙重染色結(jié)果判定 CD34以血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性,PAS陽性為染成淺粉色、紫紅色或玫瑰紅色。參照Maniotis等的標準,由CD34染色陽性的細胞及PAS陽性細胞外基質(zhì)(ECM)構(gòu)成的管道圍成的管腔樣結(jié)構(gòu)提示為內(nèi)皮依賴性血管；PAS陽性基底膜樣物質(zhì)和CD34陰性表達的腫瘤細胞圍成的管道樣結(jié)構(gòu),其內(nèi)可以見到紅細胞和(或)血漿,管腔周圍未見出血、壞死、微血栓形成及炎性細胞浸潤,該類結(jié)構(gòu)判定為VM。 3.免疫組化結(jié)果判定 Ki-67以腫瘤細胞核內(nèi)出現(xiàn)清晰棕黃色作為判斷標準。在高倍鏡下的腫瘤區(qū)內(nèi)選取10個代表性視野(×200),計算陽性腫瘤細胞數(shù)占所有腫瘤細胞數(shù)的百分比成為Ki-67指數(shù)(Ki67labeling index, Ki67LI)。GFAP定位于細胞漿,Vimentin定位于細胞漿,采用二級計分法計數(shù)陽性細胞,在光學顯微鏡200倍視野下,隨機選擇5個視野,計數(shù)每個高倍視野中陽性細胞,按Shimizu等所采用的評分標準,根據(jù)表達陽性細胞比例及表達著色強度進行計分。陽性細胞百分比計分：0分為表達陰性,1分為陽性細胞數(shù)5%,2分為陽性細胞數(shù)5%-25%,3分為陽性細胞數(shù)26%～50%,4分為陽性細胞數(shù)50%。每張切片陽性細胞的著色強度按無著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色分3分。再根據(jù)兩項乘積作為判斷表達結(jié)果,0分為陰性(-),1-2分為弱陽性(±),3-5分為陽性(+),6-7分為中等陽性(++),大于7分為強陽性(+++)。依據(jù)最終結(jié)果將GFAP和Vimentin分為兩組：低表達組包括(-)、(±)、(+)和高表達組包括(++)、(+++)。 4.統(tǒng)計學分析 應用SPSS19.0軟件包進行數(shù)據(jù)分析。頻數(shù)資料采用四格表資料的χ2檢驗和兩獨立樣本非參數(shù)檢驗,Mann-Whitney U檢驗方法比較差異。無進展生存期(PFS)為患者手術(shù)當天至首次發(fā)現(xiàn)疾病進展的時間,總生存期(OS)則為手術(shù)當天至死亡的時間,失訪患者將在生存分析中作為刪失數(shù)據(jù)處理。生存數(shù)據(jù)單因素分析用Kaplan-Meier法,并用Log-rank法進行差異顯著性比較。應用Cox比例風險模型,研究多種因素對生存時間的影響。P0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。 四、研究結(jié)果 1、血管生成擬態(tài)(VM)存在于腦膠質(zhì)瘤組織中：63例膠質(zhì)瘤患者石蠟切片經(jīng)CD34/PAS雙重染色,顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)13例(13/63,20.6%)存在VM。鏡下可觀察到VM由CD34染色陰性的腫瘤細胞圍成管道樣結(jié)構(gòu),被一層PAS染色陽性的基質(zhì)完整環(huán)繞,管腔內(nèi)可見數(shù)量不一的紅細胞,無紅細胞滲出及血液凝固現(xiàn)象。襯覆于VM管壁的細胞呈多角形,胞核大而深染,核質(zhì)比例增大證實為瘤細胞。在同一個視野中可見管腔內(nèi)CD34染色陽性的內(nèi)皮依賴性血管和具有紅細胞的CD34陰性的VM。 2、VM的存在與腫瘤組織的惡性程度及復發(fā)情況關(guān)系密切：VM在高級別腦膠質(zhì)瘤組織中發(fā)生率(WHOⅢ,4/15,19%; WHOIV,8/24,33.3%)顯著高于低級別患者(WHO Ⅱ,1/17,6.7%),其差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.025)；VM陽性組患者的復發(fā)率(12/42,28.6%)顯著高于VM陰性者(1/21,4%),兩者差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.008)。VM的存在與患者其他臨床病理參數(shù)如年齡、腫瘤大小、手術(shù)全切程度之間并無明顯相關(guān)性。 3、腦膠質(zhì)瘤組織中VM的存在與GFAP、Vimentin表達的關(guān)系：VM與在腦膠質(zhì)瘤組織中GFAP的表達呈負相關(guān)(r=-0.478,P0.05),而與在腦膠質(zhì)瘤組織中Vimentin的表達呈正相關(guān)(r=0.336,P0.01)。存在VM的膠質(zhì)瘤組織中腫瘤細胞低表達GFAP,而高表達Vimentin(P0.05)。 4、腦膠質(zhì)瘤組織中VM與Ki-67的表達的關(guān)系：在VM陽性組和VM陰性組病例中,Ki-67LI分別為24.73%±11.64%和9.95%±10.98%,兩獨立樣本非參數(shù)檢驗兩組差異具有統(tǒng)計學意義(Z=-4.74,P=0.000)(表2)。Spearman相關(guān)分析顯示,VM與在腦膠質(zhì)瘤組織中Ki-67的表達呈正相關(guān)(r=0.531,P0.01)。 5、VM與腦膠質(zhì)瘤患者預后之間的關(guān)系：63例患者中有VM發(fā)生者13例,Kaplan-Meier法統(tǒng)計結(jié)果顯示存在VM的患者術(shù)后無進展生存時間(PFS)和術(shù)后總生存時間(OS)均比VM陰性患者術(shù)后無進展生存時間(PFS)和術(shù)后總生存時間(OS)顯著縮短,Log-rank檢驗法比較生存曲線的差別,兩者差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05) 6、COX比例風險模型多因素分析結(jié)果：腫瘤組織病理分級、VM的存在、GFAP的表達、Vimentin的表達和年齡是影響膠質(zhì)瘤患者無進展生存的獨立危險因素(P0.05)；而腫瘤組織病理分級、VM的存在和Vimentin的表達是影響膠質(zhì)瘤患者術(shù)后總生存時間的獨立危險因素(P0.05)。 五、研究結(jié)論 1、膠質(zhì)瘤組織中存在血管生成擬態(tài)(VM),并且VM與腫瘤組織的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、復發(fā)密切相關(guān)； 2、膠質(zhì)瘤組織中細胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白的改變(重塑)——GFAP低表達和Vimentin高表達可能協(xié)同促進血管生成擬態(tài)發(fā)生過程中腫瘤細胞可塑性的形成； 3、膠質(zhì)瘤中存在血管生成擬態(tài)(VM)的患者預后較差,VM是影響膠質(zhì)瘤患者不良預后的獨立因素； 4、聯(lián)合檢測膠質(zhì)瘤中VM、Ki-67、GFAP及Vimentin的情況,將有助于進一步評估腫瘤組織的惡性程度及復發(fā)危險性,并可作為判斷患者臨床預后的重要指標。
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【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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本文編號：1497657