本文關鍵詞： 衛(wèi)星膠質細胞 容量激活氯電流 鈣離子 TMEM16A 磷脂酶C　出處：《河北醫(yī)科大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：作為外周神經節(jié)中一種重要的神經膠質細胞，衛(wèi)星膠質細胞(satelliteglial cells, SGCs)越來越多的受到人們的關注，它不僅可以為神經元提供營養(yǎng)及結構的支持，近來人們還發(fā)現(xiàn)它們參與了與神經元之間的信息交流，對神經元的興奮性產生了影響。因此，衛(wèi)星膠質細胞對神經元生理和病理狀態(tài)的影響成為了研究者關注的焦點之一。在神經元與衛(wèi)星膠質細胞的信息交流中，容量激活的氯通道可能發(fā)揮著很重要的作用，因為容量激活氯通道的開放可能影響著神經元和膠質細胞間谷氨酸的釋放,進而影響了神經元的興奮性，這一神經活動與疼痛的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。 容量激活的氯電流(volume-acticated chloride currents，Iclswell)屬于氯通道電流的一種。氯離子通道是體內最重要的陰離子通道，廣泛分布于各種組織，參與機體各種病理和生理過程,包括心率的形成、細胞的增殖和分化、細胞體積的調控以及細胞凋亡等。但是人們對其分子結構、調節(jié)機制、信號轉導通路的認識還相對較少。對神經系統(tǒng)容量激活氯通道的全面認識有利于我們發(fā)現(xiàn)一些疾病包括疼痛的基本病理過程，為進一步的治療提供可靠靶點。 第一部分衛(wèi)星膠質細胞上容量激活氯電流的表達及分子基礎研究 目的：了解大鼠背跟神經節(jié)（DRG）衛(wèi)星膠質細胞上是否存在容量激活氯電流，及其分子基礎。 方法：（1）全細胞膜片鉗技術記錄大鼠DRG衛(wèi)星膠質細胞上容量激活氯電流；（2）螯合細胞內鈣離子，阻斷細胞膜嘌呤受體等方法探明容量激活氯電流的激活機制；（3）慢病毒siRNA特異性敲除衛(wèi)星膠質細胞上的TMEM16A分子，研究容量激活氯電流與TMEM16A表達的關系。 結果： 1大鼠背根神經節(jié)衛(wèi)星膠質細胞上表達容量激活的氯離子電流。 全細胞膜片鉗實驗結果表明，高滲電極內液條件下，在holding電壓為-60mV下，在大鼠DRG衛(wèi)星膠質細胞可以觀察到一內向電流。100μM鞣酸（Tannic acid，，TA，氯離子通道阻斷劑）可以阻斷該電流。當將高滲細胞內液CsCl2中的Cl-用SO2-4代替后，高滲內液誘導的內向電流消失。 2衛(wèi)星膠質細胞上容量激活的氯離子電流的激活與細胞內鈣離子的釋放有關。 將高滲細胞內液中的低濃度EGTA分別用高濃度的BAPTA和高濃度的EGTA替代時，在膜片鉗下記錄，當電壓holding在-60mV時，隨著細胞體積不斷增加而出現(xiàn)的內向電流分別下降了96.9%±2.5%(P0.01, n=9)和80.8%±17.2%(P0.01, n=8)。 3容量激活氯離子電流的激活與ATP受體激活有關 在衛(wèi)星膠質細胞上，待容量激活的氯電流穩(wěn)定后，給予100μM的蘇拉明（suramin，P2受體阻斷劑）后電流與給藥之前相比下降了34.8%±2.0%(P0.01, n=5)。 4衛(wèi)星膠質細胞上容量激活的氯電流的分子基礎可能是TMEM16A 接下來我們用siRNA慢病毒特異性地敲除衛(wèi)星膠質細胞上的TMEM16A，再用上述的高滲內液在膜片鉗下記錄容量激活的氯電流，與對照組相比，轉染TMEM16A siRNA的膠質細胞的容量激活的氯電流下降了79.6%±10%(P0.01，n=8)。 結論：通過膜片鉗實驗，發(fā)現(xiàn)大鼠DRG衛(wèi)星膠質細胞上存在容積激活的氯電流，其激活可能與細胞內鈣離子的釋放有關。這種容量依賴的氯電流的分子基礎可能是TMEM16A。 第二部分背根神經節(jié)中磷脂酶C的表達 目的：研究在大鼠背根神經節(jié)中磷脂酶C (Phospholipase C, PLC)的表達特征，為進一步研究磷脂酶C是否參與了容量激活氯電流的激活過程奠定基礎。 方法：RT-PCR; western blotting;免疫熒光。 結果： 1PCR實驗結果 實驗結果顯示，在大鼠背根神經節(jié)中，四種PLC-β亞型的mRNA表達水平，以PLC-β3的表達水平最高，PLC-β4和PLC-β1次之，PLC-β2的基因表達水平最低。 2免疫熒光結果 在大鼠背根神經節(jié)中，PLC-β3、PLC-β4均大量的表達于DRG神經元上，且可以與標記中小神經元的IB4共表達，但是并不僅僅表達于中小神經元。另外，PLC-β1、β2在DRG神經元中表達量較少。 3Western blotting實驗結果 在大鼠DRG神經節(jié)中，PLC-β1、β2、β3、β4蛋白均有表達。 結論：實驗初步確定PLC-β3和PLC-β4的表達水平較高，應該作為我們下一步探明容量激活氯電流信號通路的關鍵磷脂酶C亞型。
[Abstract]:As a kind of important glial cells in peripheral ganglia in satellite glial cells (satelliteglial, cells, SGCs) is attracting more and more attention, it can not only provide nutrients and structural support for neurons, recently found that they participated in the exchange of information between God and element, on neuronal excitability produced the effect of impact. Therefore, satellite glial cells on neuronal physiological and pathological condition has become the focus of attention of researchers. In the information exchange of neurons and satellite glial cells in the activated chloride channel capacity may play a very important role, because the volume activated chloride channel opening may affect neurons and glial cells between the release of glutamate, thereby affecting the excitability of neurons, the neural activity and the occurrence of pain are closely linked.
Volume activated chloride current (volume-acticated chloride, currents, Iclswell) is a kind of chloride channel currents. Chloride channel is the most important in the anion channel, widely distributed in various organizations, participate in various pathological and physiological process of the body, including the heart rate formation, cell proliferation and differentiation, cell volume regulation and apoptosis but people the regulation mechanism of the molecular structure, and understanding of the signal transduction pathway is relatively small. We can find some diseases including the basic pathological process of pain on the comprehensive understanding of the nervous system volume activated chloride channels, provide a reliable target for further treatment.
Part 1 expression of capacity activated chlorine current on glial cells and molecular basis study
Objective: To investigate whether there is a capacity activating chlorine current and its molecular basis on the rat dorsal heel ganglion (DRG) satellite glial cells.
Methods: (1) whole cell patch clamp recording in rat DRG satellite glial cell volume activated chloride current; (2) chelation of intracellular calcium, activation of purinergic receptor blocking cell membrane method and explore the capacity of activated chloride currents; (3) lentiviral siRNA specific knockdown of TMEM16A molecules in satellite glial cells the study of the relationship between the expression of activated chloride current and the capacity of TMEM16A.
Result錛

本文編號：1477436