發(fā)布時間：2018-01-27 16:24

  本文關鍵詞： 雪旺細胞 面神經(jīng)損傷 神經(jīng)水腫 水通道蛋白1 滲透水通透系數(shù)　出處：《第二軍醫(yī)大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：[研究背景] 面癱按其發(fā)生的部位可分為中樞性和周圍性兩大類,而面神經(jīng)獨特的解剖學結(jié)構(gòu)則是造成周圍型面癱發(fā)病率高且難于治療的重要原因。面神經(jīng)從腦內(nèi)發(fā)出后即進入內(nèi)聽道,走形于一個狹小的骨性管道內(nèi)。在受到損傷因素刺激后,面神經(jīng)發(fā)生炎癥反應,出現(xiàn)水腫。但由于骨性管道的束縛,面神經(jīng)發(fā)生炎癥水腫后缺乏腫脹的空間,使面神經(jīng)管內(nèi)壓力增高,進一步影響局部血運,加重神經(jīng)損傷,形成“水腫—缺血—水腫”的惡性循環(huán)。在面癱的發(fā)病過程中,水腫起著重要的作用,如何減輕面神經(jīng)的水腫則成為面癱治療中的關鍵點。水通道蛋白(AQPs)是一類可以快速轉(zhuǎn)運水分子的膜通道蛋白,在全身多個組織、器官上參與細胞膜內(nèi)外的水代謝和水腫的形成。外周神經(jīng)主要表達水通道蛋白1,即AQP1。本課題組的前期研究證實AQP1表達于小鼠面神經(jīng)雪旺細胞的胞膜上,隨后,在小鼠面神經(jīng)離斷傷模型上發(fā)現(xiàn),面神經(jīng)受損水腫后,AQP1的表達明顯升高,且與水腫程度在時相上有一定的相關性,提示其可能參與細胞水腫的形成。在目前文獻中,尚未發(fā)現(xiàn)可明確調(diào)節(jié)AQP1表達及功能的藥物。乙酰唑胺(AZA)作為一種可能的AQP1抑制劑多有報道,但其具體作用尚存在一定爭議。因此,本研究旨在明確乙酰唑胺對面神經(jīng)雪旺細胞AQP1功能及表達的調(diào)節(jié)作用,并在小鼠面神經(jīng)離斷傷模型上探索乙酰唑胺對面神經(jīng)水腫及AQP1表達的影響,以期為臨床治療面神經(jīng)水腫提供一定的理論依據(jù)。 [研究目的] 1、在細胞水平探究乙酰唑胺對雪旺細胞AQP1的表達調(diào)節(jié)作用； 2、通過滲透壓力實驗探究乙酰唑胺對雪旺細胞AQP1的功能調(diào)節(jié)作用； 3、構(gòu)建小鼠面神經(jīng)離斷模型,探究乙酰唑胺在面神經(jīng)受損后對面神經(jīng)AQP1表達及面神經(jīng)水腫的影響,以期為臨床上治療面神經(jīng)水腫提供新的思路。 [研究方法] 1、原代培養(yǎng)小鼠面神經(jīng)雪旺細胞,確認其是否表達AQP1。 (1)選取新生5天的Balb/e小鼠,切取其雙側(cè)面神經(jīng),采用胰酶消化,差速貼壁法提純后進行原代培養(yǎng)。 (2)用AQP1和S-100免疫熒光共標染色的方法鑒定培養(yǎng)的雪旺細胞,并驗證其APQ1的表達。 2、用MTT法檢測乙酰唑胺對原代培養(yǎng)面神經(jīng)雪旺細胞增殖作用的影響。 3、行滲透壓力試驗測量雪旺細胞的水滲透系數(shù)(water permeability, Pf值),觀察乙酰唑胺對雪旺細胞AQP1表達的調(diào)節(jié)作用。原代培養(yǎng)的雪旺細胞共分為3組。A組,原代培養(yǎng)的雪旺細胞,未加干預藥物；B組,滲透壓力測量前30min,加入10μM終濃度的乙酰唑胺；C組,滲透壓力測量前30min,加入10μM終濃度的HgCl2。細胞在加入calcein-AM37℃避光孵育30min后,熒光劑進入活細胞。此時將細胞膜外的液體環(huán)境突然變?yōu)榈蜐B,細胞外水分子進入細胞,熒光劑被稀釋,利用激光共聚焦顯微鏡觀察并記錄細胞內(nèi)熒光強度的變化,并計算細胞對水分子的通透性,即Pf值。而Pf值直接反映出乙酰唑胺對雪旺細胞AQP1功能的調(diào)節(jié)作用。 4、在雪旺細胞培養(yǎng)液中分別加入0.1μM、1μM、10μM終濃度的乙酰唑胺,培養(yǎng)3天后進行RT-PCR和Western Blot檢測,觀察雪旺細胞AQP1分別在基因和蛋白水平上的表達變化情況,明確乙酰唑胺對AQP1表達的表達影響。 5、選取5周齡,20-22g健康的Balb/c小鼠,構(gòu)建面神經(jīng)離斷傷模型,觀察面神經(jīng)在面神經(jīng)管內(nèi)的走形,以及在給予乙酰唑胺干預后面神經(jīng)水腫情況和AQP1的表達情況。 (1)采取耳下切口,在耳廓軟骨前完全離斷面神經(jīng),構(gòu)建面神經(jīng)離斷傷模型,實驗組通過灌胃給予乙酰唑胺(40mg/Kg-d),對照組給予生理鹽水(40mg/Kg-d)分別在面神經(jīng)離斷后1d、3d、5d、7d處死動物,切取面神經(jīng)顱骨段,切取標本后行RT-PCR和Western Blot檢測,觀察藥物對面神經(jīng)AQP1的表達的影響。 (2)同法構(gòu)建小鼠面神經(jīng)離斷模型,實驗組和對照組處理同上,分別在面神經(jīng)離斷后1d、3d、5d、7d后切取頭顱標本,行4%多聚甲醛固定、10%中性EDTA浸泡脫鈣、20%與30%蔗糖階梯脫水后,進行冰凍切片,觀察實驗組和對照組中不同時間點面神經(jīng)的水腫情況。 [結(jié)果] 1、在Balb/c小鼠的面神經(jīng)原代培養(yǎng)的雪旺細胞上行AQP1和S-100免疫熒光共標染色后,熒光顯微鏡下可見二者均顯色,存在于同一細胞中,證實雪旺細胞上明確表達AQP1。 2、乙酰唑胺對雪旺細胞的增殖活力無明顯影響。 3、雪旺細胞滲透水通透性(Pf值)的測量結(jié)果顯示,A組(對照組)灌流曲線呈典型的“Z”形,Pf值最大,對水的通透性最好；B組(10μM終濃度的乙酰唑胺孵育30min)灌流曲線仍呈典型的“z”形,細胞的Pf值較A組小。C組(10μM終濃度的HgCl2孵育30min)未見典型的“Z”灌流曲線,其Pf值明顯較A組、B組為小,即Pf值：A組B組C組。 4、在原代細胞培養(yǎng)的雪旺細胞內(nèi)加入不同濃度乙酰唑胺共培養(yǎng)后,進行western和RT-PCR檢測,結(jié)果顯示在終濃度為0.1μM時,乙酰唑胺即能明顯降低雪旺細胞AQP1基因及蛋白的表達,且在實驗濃度范圍內(nèi)并無明顯濃度依賴性的作用。 5、對構(gòu)建面神經(jīng)離斷傷模型的小鼠,每日灌胃給予乙酰唑胺(實驗組)或生理鹽水(對照組),分別于離斷傷后第1、3、5、7天取材行Western Blot和RT-PCR檢測。Western Blot結(jié)果顯示實驗組AQP1的表達在傷后3天低于對照組,在傷后7天高于對照組,傷后1、5天無明顯區(qū)別。RT-PCR結(jié)果顯示實驗組AQP1的表達在傷后1、3天低于對照組,在傷后5、7天高于對照組。 6、小鼠面神經(jīng)在顱骨內(nèi)走形：面神經(jīng)自腦內(nèi)穿出進入顱骨面神經(jīng)管內(nèi),在距離顱骨入口及出口處不遠轉(zhuǎn)彎,形成“S”形。面神經(jīng)走行在耳蝸段時與蝸水管靜脈伴行,此處面神經(jīng)管骨質(zhì)不連續(xù),繼續(xù)向外至迷路段面神經(jīng)管再次移行為完整的骨性管道包繞面神經(jīng)。 7、面神經(jīng)離斷后給予乙酰唑胺對神經(jīng)水腫的影響：通過對面神經(jīng)顳骨段冰凍切片的觀察及測量,面神經(jīng)在離斷后第1天即出現(xiàn)明顯的腫脹,第3天時達到高峰。小鼠面神經(jīng)在離斷后第3天,實驗組比對照組神經(jīng)腫脹程度較輕,但在離斷后第1、5、7天時,面神經(jīng)腫脹程度與是否給藥無明顯區(qū)別。 [結(jié)論] 1、在小鼠來源的原代培養(yǎng)雪旺細胞上,乙酰唑胺可明顯抑制AQP1的表達。 2、乙酰唑胺對雪旺細胞增殖無明顯的抑制作用。 3、在小鼠面神經(jīng)來源的原代培養(yǎng)雪旺細胞上,乙酰唑胺可抑制AQP1的表達和功能。 4、在面神經(jīng)離斷傷模型上,乙酰唑胺可降低小鼠的AQP1表達的峰值(傷后第3天),并降低面神經(jīng)水腫峰值的程度(傷后第3天),但在恢復期乙酰唑胺對水腫的影響不明顯。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第二軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R745.12

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

1 母生梅,暨荀鶴,馬兵,于和鳴,李學軍;乙酰唑胺對大鼠腎臟近曲小管上皮細胞作用的差異蛋白分析及其與AQP1抑制的關系[J];藥學學報;2003年03期

2 ;Effects of acetazolamide and anordiol on osmotic water permeability in AQP1-cRNA injected Xenopus oocyte[J];Acta Pharmacologica Sinica;2004年01期

3 ;Acetazolamide inhibits aquaporin-1 protein expression and angiogenesis[J];Acta Pharmacologica Sinica;2004年06期

相關博士學位論文 前1條

1 汪匯;面神經(jīng)離斷傷后面神經(jīng)管內(nèi)神經(jīng)水腫及AQP1表達變化情況的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學;2011年

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本文編號：1468889