本文關(guān)鍵詞： 癲癇 線粒體分裂 動力相關(guān)蛋白1 線粒體分裂蛋白抑制劑 細胞凋亡 神經(jīng)保護　出處：《鄭州大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景癲癇是多種病因所引起的反復(fù)發(fā)作的大腦神經(jīng)元高度同步異常放電所致的腦功能失調(diào)為特征的慢性腦部疾病。癲癇的長期發(fā)作不僅對病人的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重的影響,而且對患者家庭及社會將會增加沉重的負(fù)擔(dān)。癲癇發(fā)作可以導(dǎo)致神經(jīng)元損傷,而神經(jīng)元損傷又會明顯增加其后癲癇發(fā)作的危險性,但是目前,癲癇發(fā)作導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的機制尚不完全清楚,而且針對癲癇發(fā)作導(dǎo)致的神經(jīng)損傷的神經(jīng)保護策略還很有限。線粒體作為真核生物細胞內(nèi)具有兩層膜的細胞器,在有氧氧化能量代謝,細胞信號分子傳導(dǎo)和細胞凋亡方面發(fā)揮著整合平臺的作用。由于神經(jīng)細胞是生物體內(nèi)能量代謝需求旺盛的細胞,所以尤其依賴線粒體的功能。近年來的癲癇研究中,線粒體功能障礙引起了極大的關(guān)注。活體細胞內(nèi)的線粒體不斷地進行著分裂/融合,是一個不斷變化的細胞器。線粒體融合使線粒體變?yōu)殚L管狀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),線粒體分裂促使線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)瓦解為片斷。正常情況下,線粒體分裂和融合之間的動態(tài)平衡導(dǎo)致線粒體網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)和形態(tài)不斷地發(fā)生著的重塑和變化,從而適應(yīng)不同的生理活動需要。線粒體動態(tài)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對各種病理生理性刺激高度敏感,諸如氧化應(yīng)激,缺血,老齡等異常病理情況均有可能導(dǎo)致線粒體分裂融合失衡。近來的研究關(guān)注到,線粒體分裂/融合紊亂在諸如肌萎縮側(cè)索硬化,亨廷頓病,阿爾海默氏病及帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的線粒體自噬,神經(jīng)元損傷和凋亡等病理過程中發(fā)揮著重要作用。Drp1(dynamin-related protein 1)即動力相關(guān)蛋白1,是調(diào)控真核細胞線粒體分裂的關(guān)鍵蛋白。Mdivi-1(mitochondrial division inhibitor)通過失活三磷酸鳥苷(guanosine triphosphate,GTP)酶,選擇性地抑制動力相關(guān)蛋白1,從而發(fā)揮抑制線粒體分裂的作用。已經(jīng)證實線粒體的氧化應(yīng)激損傷參與癲癇的病理過程,但是目前,線粒體分裂在癲癇發(fā)作后神經(jīng)損傷中的作用尚不清楚,線粒體分裂抑制劑Mdivi-1對癲癇發(fā)作導(dǎo)致的神經(jīng)損傷是否具有神經(jīng)保護作用及具體機制如何至今很少有報道。研究目的本研究通過建立的氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型,觀察致癇及Mdivi-1預(yù)處理大鼠行為學(xué),神經(jīng)元缺失,細胞凋亡,海馬神經(jīng)元線粒體Drp1及凋亡相關(guān)物質(zhì)細胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子AIF和半胱天冬酶3表達水平變化,研究線粒體分裂在癲癇神經(jīng)元損傷中的作用,探討癲癇神經(jīng)元損傷的相關(guān)保護機制。材料與方法雄性健康成年的96只SD大鼠,體重在200-250g,隨機分成正常對照組(CON組),匹羅卡品組(PILO組),匹羅卡品+二甲基亞砜陰性對照組(PILO+DMSO組),Mdivi-1干預(yù)組(PILO+Mdivi-1)組四組,PILO組,PILO+DMS組和PILO+Mdivi-1組三組大鼠腹腔注射氯化鋰(127mg/kg)-匹羅卡品(30mg/kg)誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)癲癇。在注射匹羅卡品前30min,PILO+Mdivi-1和PILO+DMSO組組分別給予腹腔注射Mdivi-1(1.2mg/kg)和0.1%的二甲基亞砜(DMSO),CON組的大鼠給予等體積生理鹽水用來代替匹羅卡品、二甲基亞砜及Mdivi-1。SE發(fā)作1h時,使用地西泮(10mg/kg)腹腔注射終止大鼠的癲癇發(fā)作。按照Racine標(biāo)準(zhǔn)對癇性發(fā)作級別進行判斷,分別記錄造模成功大鼠的潛伏期及致癇成功率。SE發(fā)作后24h,處死大鼠前對其腦電圖進行描記,繼之麻醉大鼠后進行斷頭取腦,大鼠的雙側(cè)海馬被迅速地分離出來。大鼠海馬Drp1 mRNA的表達水平使用RT-PCR法進行檢測,大鼠海馬Drp1、caspase-3、CytC和AIF的蛋白表達水平使用Western blot方法進行檢測。SE后72h時,麻醉其余大鼠后,進行斷頭取腦。使用Nissl染色對大鼠海馬神經(jīng)元的缺失及損傷狀況進行觀測,使用TUNEL法對大鼠海馬細胞凋亡情況進行觀察。在本研究中,采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來表示所有的研究數(shù)據(jù)資料,應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析。應(yīng)用卡方檢驗(Chi-Square Tests)對致癇成功率進行比較,其余使用單因素方差分析(one-way analysis of variance)對組間數(shù)據(jù)進行比較,兩組間比較采用LSD(Least—SignificantDifference)-t檢驗,以α=0.05作為研究的顯著性水準(zhǔn)。結(jié)果:1:大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)及腦電圖描記結(jié)果:正常對照組大鼠行為表現(xiàn)正常,無癇性發(fā)作,腦電圖的描記結(jié)果正常;依據(jù)Racine標(biāo)準(zhǔn)的癲癇發(fā)作分級,在PILO、PILO+DMSO和PILO+Mdivi-1三組大鼠腹腔注射匹羅卡品以后,其癲癇發(fā)作級別可以達到Ⅳ-Ⅴ級,甚至出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài);三組大鼠之間的發(fā)作潛伏期及致癇成功率無顯著性的統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05);匹羅卡品腹腔注射后,三組大鼠的腦電圖描記到大量的高波幅的尖波、棘波,棘慢及尖慢綜合波發(fā)放。2.病理學(xué)觀察結(jié)果:2.1 Nissl染色觀察結(jié)果:SE后72h時,與正常對照組相比,PILO、PILO+DMSO和PILO+Mdivi-1三組大鼠海馬CA3區(qū)的神經(jīng)元數(shù)目出現(xiàn)明顯減少,可以發(fā)現(xiàn)有明顯的神經(jīng)元缺失統(tǒng)計學(xué)有顯著性的差異(p0.05);在SE后72h時,與PILO組相比,PILO+DMSO組大鼠的海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目出現(xiàn)減少,統(tǒng)計學(xué)無顯著性的差異(p0.05);PILO+Mdivi-1組大鼠海馬的CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目出現(xiàn)明顯的增多,統(tǒng)計學(xué)有顯著性的差異(p0.05)。2.2細胞凋亡TUNE法檢測結(jié)果:在SE后72h時,與正常對照組比,PILO、PILO+DMSO和PILO+Mdivi-1三組大鼠的海馬CA3區(qū)存在有明顯的細胞凋亡,有顯著性的統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。在SE后72h時,與PILO組相比,PILO+DMSO組大鼠海馬CA3區(qū)的細胞凋亡出現(xiàn)增多,無顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05),PILO+Mdivi-1組大鼠的海馬CA3區(qū)的細胞凋亡數(shù)目出現(xiàn)明顯的減少,有顯著性統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。3.Western blot結(jié)果:與正常對照組相比,SE后24h時,PILO、PILO+DMSO和PILO+Mdivi-1三組大鼠海馬存在有Drp1表達水平明顯升高,caspase-3顯著激活,CytC異常釋放及AIF不正常移位,統(tǒng)計學(xué)有顯著性差異(p0.05)。癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后24h時,與PILO組相比,PILO+DMSO組Drp1表達水平升高,PILO+DMSO組Cyt C釋放、AIF移位和caspase-3激活增加,統(tǒng)計均無顯著性差異(p0.05),PILO+Mdivi-1組大鼠海馬Drp1表達水平降低,統(tǒng)計均無顯著性差異(p0.05),而Cyt C釋放、AIF移位和caspase-3激活減少,統(tǒng)計有顯著性差異(p0.05)。4.RT-PCR結(jié)果:與CON組相比,在SE發(fā)作后24h時PILO組、PILO+DMSO組和PILO+Mdivi-1組三組大鼠海馬Drp1 mRNA表達水平顯著升高,差異有顯著性(p0.05);SE后24h時與PILO組相比,PILO+DMS組及PILO+Mdivi-1組Drp1 mRNA表達水平降低。統(tǒng)計均無顯著性差異(p0.05)。結(jié)論1.大鼠海馬神經(jīng)元Drp1及Drp1 mRNA的表達水平在癲癇持續(xù)狀態(tài)后出現(xiàn)明顯的增高,提示線粒體分裂很可能參與到了癲癇的病理損傷過程。2:線粒體分裂蛋白抑制劑Mdivi-1的神經(jīng)保護作用可能是通過阻斷致癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡時caspase-3顯著激活,Cyt C異常釋放及AIF不正常移位和來實現(xiàn);抑制線粒體分裂有可能成為癲癇發(fā)作后神經(jīng)損傷新的治療策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R742.1

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