本文關(guān)鍵詞： 核相關(guān)因子2 Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1 曲古抑菌素A 重組質(zhì)粒 蛋白酶體途徑 溶酶體途徑　出處：《南京大學(xué)》2014年碩士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景：細(xì)胞防御的一個(gè)重要機(jī)制就是Keap1-Nrf2信號(hào)通路的激活。生理狀態(tài)下,Keap1 (Kelch-like ECH-associated proteinl)作為Cul3依賴(lài)性E3 (ubiquitin-protein ligase)泛素連接酶復(fù)合物的銜接蛋白,介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 (NF-E2-related factor 2)泛素化,被26S蛋白酶體降解。在應(yīng)激或傷害條件下,Nr-2與Keap1解偶聯(lián)并轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi),調(diào)節(jié)其下游靶基因表達(dá)。因此,胞質(zhì)蛋白Keap1對(duì)于Nrf2的激活具有重要意義。催化蛋白去乙�；慕M蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases, HDAC)被認(rèn)為可能是治療許多人類(lèi)疾病的有用靶點(diǎn),包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。研究表明,HDAC抑制劑能夠通過(guò)激活lKeap1-Nrf2通路,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用,但是對(duì)其激活機(jī)制目前尚未完全闡明。本研究旨在探討在RAW 264.7細(xì)胞中,HDAC抑制劑TSA調(diào)控Keap1-Nrf2信號(hào)通路的可能作用機(jī)制。研究目的：1、確認(rèn)TSA可以激活Keap1-Nrf2通路；2、構(gòu)建真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-6cmyc-Keap1(1-624), pcDNA3.1-6cmyc-Keap1(1-314)和pcDNA3.1-6cmyc-Keap1(315-624),研究TSA作用于Keap1的可能功能片段；3、研究TSA是否能夠通過(guò)蛋白水平調(diào)控Keap1。若能,則進(jìn)一步探討TSA促進(jìn)Keap1蛋白降解的可能途徑。研究方法：1、培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞,利用不同濃度的TSA(10ng/ml,30ng/ml, 100ng/ml)處理細(xì)胞16h, Western Blot法檢鋇Keap1、 Nrf2、 HO1和NQO1蛋白表達(dá)水平；RT-PCR法檢鋇Keap1 mRNA表達(dá)水平；2、培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞,利用一定濃度的TSA(30ng/ml)處理細(xì)胞4h,免疫熒光法檢測(cè)Nrf2的核易位情況。3、利用限制性?xún)?nèi)切酶和DNA測(cè)序?qū)?gòu)建的重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定；4、培養(yǎng)RAw 264.7細(xì)胞,TSA(30ng/ml)和ActD(0.5ug/ml)共處理細(xì)胞12h, Western Blot檢測(cè)]Keap1蛋白表達(dá)情況,RT-PCR檢鋇Keapl mRNA表達(dá)情況；5.Lipo 2000轉(zhuǎn)染RAW264.7細(xì)胞,TSA (30ng/ml)處理16h,收集轉(zhuǎn)染48h的蛋白,外源性Keap1蛋白表達(dá)水平利用Western Blot法檢測(cè)；6、培養(yǎng)RAW 264.7細(xì)胞,TSA (30ng/ml)和MG-132(5umol/L)/3-MA (5mmol/L)共處理細(xì)胞12h,免疫印跡法檢鋇Keap1蛋白表達(dá)水平。研究結(jié)果：1、TSA抑制內(nèi)源性Keap1蛋白和mRNA表達(dá)水平,且這種抑制作用具有劑量和時(shí)間依賴(lài)性；2、TSA促-Nrf2核易位,同時(shí)上調(diào)其下游蛋白表達(dá)；3、重組質(zhì)粒經(jīng)過(guò)酶切鑒定和DNA序列比對(duì),證實(shí)構(gòu)建成功；4、TSA和ActD共處理后,Keap1蛋白表達(dá)明顯減少,而Keap1 mRNA水平無(wú)明顯變化；5、TSA促進(jìn)外源性Keap1蛋白降解；6、蛋白酶抑制劑MG-132和自噬抑制劑3-MA不影響TSA對(duì)Keap1蛋白的降解。結(jié)論：HDAC抑制劑TSA能夠抑制Keap1表達(dá),激活Nrt2,引發(fā)下游反應(yīng)。TSA不僅可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄水平抑制Keap1表達(dá),還能從蛋白水平抑制其表達(dá),即TSA可以直接促進(jìn)Keap1蛋白降解,而導(dǎo)致Keap1蛋白降解的途徑有可能不依賴(lài)蛋白酶體途徑和溶酶體途徑,詳細(xì)機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。
[Abstract]:Background: one of the important mechanisms of cell defense is the activation of Keap1-Nrf2 signaling pathway. Keap1 Kelch-like ECH-associated protein 1 as a Cul3 dependency E _ 3 (. Ubiquitin-protein ligase) the binding protein of the ubiquitin ligase complex. The transcriptional factor Nrf2 / NF-E2-related factor 2) is ubiquitized and degraded by 26s proteasome under stress or injury conditions. Nr-2 is uncoupled with Keap1 and transferred into the nucleus to regulate its downstream target gene expression. Cytoplasmic protein Keap1 plays an important role in the activation of Nrf2. Histone deacetylases catalyzes the deacetylation of proteins. HDAC) may be a useful target for the treatment of many human diseases, including central nervous system diseases. Studies have shown that HDACs inhibitors can activate the lKeap1-Nrf2 pathway. This study was designed to explore the role of neuroprotective effect in RAW 264.7 cells, but the mechanism of its activation has not been fully elucidated. The possible mechanism of Keap1-Nrf2 signaling pathway regulated by HDAC inhibitor TSA. Objective: to confirm that TSA can activate Keap1-Nrf2 pathway; 2.Eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1-6cmyc-Keap11-624) was constructed. PcDNA3.1-6cmyc-Keap1 (1-314) and pcDNA3.1-6cmyc-Keap1 (315-624). The possible functional fragments of TSA acting on Keap1 were studied. 3. To study whether TSA can regulate Keap1 through protein level, and if so, to further explore the possible pathway of TSA promoting Keap1 protein degradation. RAW 264.7 cells were cultured and treated with different concentrations of TSA 10 ng / ml 30 ng / ml, 100 ng / ml for 16 h. The expression levels of barium Keap1, Nrf2, HO1 and NQO1 protein were detected by Western Blot method. The expression of barium Keap1 mRNA was detected by RT-PCR method. 2. RAW 264.7 cells were cultured and treated with a certain concentration of TSA 30 ng / ml for 4 h. The nuclear translocation of Nrf2 was detected by immunofluorescence method. The recombinant plasmid was identified by restriction endonuclease and DNA sequencing. (4) RAw 264.7 cells were co-treated with TSA 30 ng / ml and ActDX 0.5 g / ml for 12 h. The expression of Keap1 protein was detected by Western Blot. The expression of barium Keapl mRNA was detected by RT-PCR. 5. The RAW264.7 cells were transfected with Lipo 2000 for 16 h and the protein was collected after transfection for 48 h. The expression of exogenous Keap1 protein was detected by Western Blot. 6. The cells were co-treated with RAW 264.7 cells at 30 ng / ml and 5 mmol / L MG-132(5umol/L)/3-MA for 12 h. The expression of barium Keap1 protein was detected by Western blotting. Results the expression of endogenous Keap1 protein and mRNA was inhibited by 1: 1 TSA in a dose-and time-dependent manner. 2TSA promoted the nuclear translocation of -Nrf2 and up-regulated its downstream protein expression. 3. The recombinant plasmid was successfully constructed by restriction endonuclease digestion and DNA sequence alignment. 4After co-treatment of TSA and ActD, the expression of Keap1 protein decreased significantly, but the level of Keap1 mRNA did not change significantly. 5TSA promoted the degradation of exogenous Keap1 protein; 6. Protease inhibitor MG-132 and autophagy inhibitor 3-MA did not affect the degradation of Keap1 protein by TSA. Conclusion TSA can inhibit the expression of Keap1. Activation of Nrt2, initiation of downstream reaction. TSA can not only inhibit the expression of Keap1 through transcription level, but also inhibit its expression from the protein level, that is, TSA can directly promote the degradation of Keap1 protein. However, the pathway leading to the degradation of Keap1 protein may not depend on the proteasome pathway and lysosomal pathway, and the detailed mechanism remains to be further studied.
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R741

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本文編號(hào)：1455983