本文關鍵詞：NSCs遞送LINGO-1-Fc治療實驗性自身免疫性腦脊髓炎的實驗研究

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【摘要】：研究背景實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)是人類多發(fā)硬化癥(MS)的動物模型。MS是一種由自身免疫反應引起的以炎性脫髓鞘為主要特征的中樞神經系統(tǒng)(CNS)退行性疾病,目前困擾著全球超過250萬人的健康。LINGO-1是軸突髓鞘形成的負調控因子,具有抑制軸突生長,阻止髓鞘再生,促進少突膠質細胞和神經元凋亡的作用。在抗炎治療的基礎上,神經干細胞(NSCs)移植被認為可能是治療該病的一種有效途徑。目標本研究從胎鼠海馬中分離NSCs,通過分子生物學手段將其改造成穩(wěn)定過表達分泌型LINGO-1拮抗劑LINGO-1-Fc的NSCs,研究NSCs遞送LINGO-1-Fc是否能通過促進髓鞘再生對EAE小鼠有治療作用。方法雌性C57BL/6小鼠被隨機分為3組：模型組,GFP-NSCs組,LINGO-1-Fc-NSCs組。在所有實驗小鼠經MOG35-55主動免疫后第23天,LINGO-1-Fc-NSCs組經尾靜脈注射1×106個LINGO-1-Fc-GFP-NSCs (200ul)、GFP-NSCs組注射1×106個GFP-NSCs (200ul)、模型組注射200ul PBS,每日觀察小鼠行為并進行神經功能評分。于免疫后第48天處死,取小鼠脊髓腰骶膨大組織進行組織病理學染色：HE染色觀察炎性細胞浸潤、LFB染色觀察髓鞘脫失、免疫熒光染色檢測內源性和外源性MBP+、GFAP+、NeuN+細胞數(shù)目,以及小膠質／巨噬細胞的數(shù)目和中性粒細胞的浸潤；同時采用流式細胞術分析了CNS和脾中CD4+T細胞亞群的變化。在體外實驗中,應用免疫熒光染色研究了LINGO-1-Fc-NSCs培養(yǎng)上清對OPCs增殖和分化的影響。結果1.利用慢病毒介導的方法建立了穩(wěn)定表達LINGO-1-Fc的NSCs細胞株,LINGO-1-Fc感染后48h,NSCs的LINGO-1-Fc分泌量高達195.00±9.75ng/106 cells,顯著高于NSCs組和GFP-NSCs組。2.本實驗中,小鼠從免疫后第13天開始發(fā)病,至免疫后第19天進入高峰期,高峰期維持時間較長,細胞移植后13-25天,GFP-NSCs組較模型組顯著降低了神經功能評分(P0.01),而LINGO-1-Fc-NSCs的起效時間比GFP-NSCs早11天,而且作用效果更加明顯,在細胞移植后第2天至處死前,LINGO-1-Fc-NSCs組較模型組(P0.001)和GFP-NSCs組(P0.05)均顯著改善了臨床功能評分,將疾病高峰期縮短至6天。3.HE染色結果顯示,相對于模型組(P0.001)和GFP-NSCs組(P0.01),LINGO-1-Fc-NSCs組脊髓“袖套樣”結構明顯減少,外周炎性細胞浸潤面積占脊髓面積的比值顯著降低；LFB染色顯示,LINGO-1-Fc-NSCs組較其他兩組髓鞘脫失比例顯著降低。4.免疫熒光染色結果：(1) LINGO-1-Fc-NSCs組較模型組(P0.01)和GFP-NSCs組(P0.01)總的MBP熒光強度(MFI)顯著增強,LINGO-1-Fc-NSCs組和GFP-NSCs組都有外源性少突膠質細胞(GFP+/MBP+細胞)分化,但兩組之間差異不顯著；(2) LINGO-1-Fc-NSCs組和GFP-NSCs組均存在外源性神經元分化,且LINGO-1-Fc組較GFP-NSCs組外源神經元數(shù)目明顯增多(P0.05)；(3)模型組病灶部位出現(xiàn)明顯的星形膠質細胞增生,且伴隨有大量的炎性細胞聚集,相對于模型組,GFP-NSCs組和LINGO-1-Fc-NSCs組總的星形膠質細胞(GFAP+)數(shù)目和內源性星形膠質細胞(GFAP+/GFP-)數(shù)目均明顯減少,且LINGO-1-Fc-NSCs組較GFP-NSCs組總的星形膠質細胞數(shù)目(P0.05)和外源性星形膠質細胞(GFAP+/ GFP+)數(shù)目(P0.001)減少；(4)相對于模型組,LINGO-1-Fc-NSCs組Iba-1+細胞數(shù)目明顯減少(P0.01),而LINGO-1-Fc-NSCs組較GFP-NSCs組Iba-1+細胞數(shù)目無明顯變化(P=0.066)；(5)各組小鼠脊髓均有具典型分葉核(多為3葉)的中性粒細胞浸潤,且主要分布于脊髓白質,相對于模型組,GFP-NSCs組(P0.05)和LINGO-1-Fc-NSCs(P0.01)組Gr-1+細胞數(shù)目均顯著減少；5.流式分析顯示,與模型組相比,LINGO-1-Fc-NSCs組降了低外周CD4+/IL-17+比例(P0.05)。6.體外實驗表明,和GFP-NSCs組相比,LINGO-1-Fc-NSCs培養(yǎng)上清可抑制OPCs增殖,并促進少突膠質細胞分枝形成,促進OPCs向成熟少突膠質細胞分化。結論1.LINGO-1-Fc-NSCs和GFP-NSCs移植均可緩解EAE病情,但LINGO-1-Fc-NSCs較GFP-NSCs起效時間更早、作用效果更明顯；2. LINGO-Fc-NSCs具有重要的神經修復作用,移植的LINGO-1-Fc-NSCs主要促進內源性少突膠質細胞成熟、促進髓鞘修復和重建、抑制OPCs和內源性星形膠質細胞增生、抑制外源性星形膠質細胞分化、促進外源性神經元分化；3.移植的LINGO-1-Fc-NSCs具有明顯的免疫調節(jié)功能,LINGO-1-Fc-NSCs可抑制外周炎性細胞浸潤CNS、抑制外周Th17分化、抑制CNS小膠質/巨噬細胞活化。
【學位授予單位】：陜西師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R744.51

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本文編號：1242956