本文關鍵詞：NTR1激動劑PD149163對局灶性腦缺血再灌注損傷大鼠的神經(jīng)保護作用及其機制

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【摘要】：腦卒中是一種急性腦血管疾病,是由于腦部血管突然破裂或因血管阻塞導致血液不能流入大腦而引起腦組織損傷的一組疾病,具有高發(fā)病率、致殘率與死亡率的特點,其中缺血性腦卒中的發(fā)病率明顯高于出血性腦卒中,是全球范圍內(nèi)導致殘疾和死亡的主要原因。組織型纖溶酶原激活劑(tissue plasminogen activator, tPA)是唯一獲得批準的臨床治療急性缺血性腦卒中的藥物,但由于它具有治療時間窗窄、不良反應嚴重、療效有限的缺點,大大限制了其在臨床中的使用。腦缺血損傷所涉及的病理生理機制十分復雜,隨著對缺血級聯(lián)反應和腦缺血發(fā)病機制相關通路的研究,越來越多的人認為作用于單一機制的藥物或治療方法不能影響整個級聯(lián)反應而達到治療缺血性腦卒中的效果。因此,尋找新的靶點來研發(fā)新的缺血性腦卒中的治療方法或藥物迫在眉睫。近期研究發(fā)現(xiàn),低溫治療可以通過干預缺血損傷后多個病理生理過程而達到腦保護的效果,并且影響了多個與細胞死亡相關的通路,如神經(jīng)興奮性毒性、凋亡和自由基損傷、血腦屏障等相關通路,是潛在的缺血性腦卒中的治療方法。低溫治療除了使用物理降溫的手段,還可以使用以中樞溫度感受器為靶點的藥物,PD149163是一種可以作用于中樞溫度感受器的化合物,同時它也是選擇性神經(jīng)降壓素受體1的激動劑。PD149163可以透過血腦屏障,外周給藥后可以產(chǎn)生一系列中樞神經(jīng)系統(tǒng)作用,如促進認知作用、抗精神病作用、抗焦慮作用以及減少食物攝入量作用等,它還可以有效地誘導大鼠調(diào)節(jié)性低溫的產(chǎn)生。因此,深入研究和探索PD149163對腦缺血的治療效果及機制,對于腦缺血的臨床治療具有重要意義。本文研究了PD149163對局灶性腦缺血再灌注大鼠急性期損傷的神經(jīng)保護作用并初步闡述其作用機制。我們研究發(fā)現(xiàn)PD149163能夠誘導大鼠體溫降低,改善腦缺血再灌注后血神經(jīng)血管單元功能、抑制細胞凋亡,其神經(jīng)保護作用可能與阻滯JNK和AMPK/mTOR信號通路進而抑制自噬有關。目的：研究NTR1激動劑PD149163對局灶性腦缺血再灌注大鼠急性期神經(jīng)損傷的保護作用及機制。方法：1.應用2月齡以上雄性SD大鼠,采用線栓法建立局灶性腦缺血再灌注模型,于復灌后1.5 h、4.5 h腹腔注射給予PD149163 (0.5mg/kg),復灌72 h處死動物收集標本。通過2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyl-2H-tetrazolium chloride, TTC)染色計算腦梗死體積以及神經(jīng)運動功能評分觀察PD149163對腦缺血再灌注急性期損傷的保護作用。2.通過缺血后0h、4h、7h和10h腹腔注射給予PD149163 (0.5mg/kg),觀察缺血后900 min內(nèi)PD149163對大鼠體溫的影響。3.應用二維激光散斑成像技術和多普勒激光血流儀實時監(jiān)測腦缺血再灌注實驗中大鼠的局部腦血流變化情況。4.應用免疫組織化學染色法觀察不同腦區(qū)(損傷側(cè)皮層和紋狀體)中神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細胞形態(tài)和數(shù)量的改變。5.應用蛋白質(zhì)免疫印跡(Western blotting)法檢測小膠質(zhì)細胞、血腦屏障組成成分、凋亡和自噬相關蛋白表達量的變化情況,如基質(zhì)金屬蛋白酶9 (matrix metalloproteinases9,MMP-9)及其底物緊密連接蛋白occludin、促凋亡蛋白Bax、抑凋亡蛋白Bcl-2、Caspase 3、自噬相關蛋白LC3、P62及Beclin1、JNK、p-JNK、AMPK、p-AMPK(Thr172)以及mTOR、p-mTOR(Ser 2448)。結(jié)果：1.PD149163能夠?qū)е麓笫篌w溫下降,減輕局灶性腦缺血再灌注急性期神經(jīng)血管單元損傷,但不影響腦缺血過程中病灶區(qū)內(nèi)腦血流的變化于缺血后0h、4h、7h和10h腹腔注射給予PD149163 (0.5mg/kg),可使大鼠體溫降低2-5℃；使用多普勒激光血流儀篩選造模成功的大鼠,于復灌后1.5h、4.5 h腹腔注射給予PD149163(0.5mg/kg)可顯著降低大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型大鼠的腦梗死體積,并改善其神經(jīng)功能障礙；PD149163能夠顯著減輕大鼠腦缺血再灌注急性期大鼠患側(cè)皮層與紋狀體腦區(qū)內(nèi)神經(jīng)元的損傷,抑制星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞的活化與增殖；PD149163不影響腦缺血過程中病灶區(qū)內(nèi)腦血流的變化。提示PD149163對局灶性腦缺血再灌注大鼠急性期的神經(jīng)損傷具有保護作用。2.PD149163改善腦缺血再灌注損傷后的血腦屏障損傷PD149163顯著降低了缺血半影區(qū)MMP-9的表達,并抑制其底物緊密連接蛋白occludin的降解。3.PD149163抑制大鼠腦缺血再灌注損傷所致的細胞凋亡及自噬PD149163使缺血半影區(qū)中Caspase-3和Bax的表達量降低,Bcl-2的表達量增多,Bax/Bcl-2比率下降；PD149163顯著抑制P62蛋白表達的下降,降低LC3Ⅱ/LC3 I比率、抑制Beclinl蛋白的表達。4.PD149163抑制腦缺血再灌注損傷中的JNK和AMPK/mTOR信號轉(zhuǎn)導PD149163可以降低p-JNK/JNK和p-AMPK (Thr172)/AMPK的比率,并增加p-mTOR (Ser2448)/mTOR的比率,顯著抑制JNK和AMPK Thr172的磷酸化、增加mTOR Ser 2448的磷酸化,使得JNK和AMPK的活性下降、mTOR的活性增高。結(jié)論：1.PD149163對大鼠局灶性腦缺血再灌注急性期損傷具有神經(jīng)保護作用,能減輕大鼠局灶性腦缺血再灌注急性期所致的神經(jīng)血管單元損傷,但不影響腦缺血再灌過程中病灶區(qū)的腦血流。2.PD149163可能通過阻滯JNK和AMPK-mTOR自噬相關信號通路而抑制自噬,對抗腦缺血再灌注急性期所致細胞凋亡。綜上所述,本研究工作的主要創(chuàng)新點在于：1.發(fā)現(xiàn)PD149163對局灶性腦缺血再灌注大鼠急性期損傷具有神經(jīng)保護作用。2.初步闡明PD149163通過改善神經(jīng)血管單元功能、抑制自噬通路以及對抗細胞凋亡而發(fā)揮神經(jīng)保護作用。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743

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