朊病毒病又稱傳播性海綿狀腦病(TSEs),是一類罕見的致死性神經(jīng)退行性疾病。在人類中主要包括克雅氏病(Creutzfeldt-Jakob disease, CJD)、庫魯病(Kuru)、家族型致死性失眠癥(fatal familial insomnia, FFI)和吉斯特曼-施特勞斯綜合征(Gerstmann-Straussler-Scheinker syndrome, GSS)等,在動(dòng)物中主要包括牛海綿狀腦病(bovine spongiform encephalopathy, BSE)和羊瘙癢病(Scrapie)等。朊病毒病的臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性共濟(jì)失調(diào)、震顫、認(rèn)知障礙,最終導(dǎo)致死亡,其病理特征為中樞神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)海綿狀變性、淀粉樣斑塊、神經(jīng)元丟失以及星形膠質(zhì)細(xì)胞增生等。該病目前較普遍認(rèn)同的機(jī)制為正常構(gòu)象的朊蛋白(PrPc)錯(cuò)誤折疊,轉(zhuǎn)變?yōu)楫惓ｋ玫鞍?PrPSc),產(chǎn)生神經(jīng)毒性,在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中積累并最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡線粒體是真核細(xì)胞中有氧呼吸產(chǎn)生ATP的部位,是細(xì)胞代謝所需能量的主要來源。近年的研究發(fā)現(xiàn),線粒體是一種具有高度動(dòng)態(tài)變化的細(xì)胞器,存在持續(xù)的轉(zhuǎn)運(yùn)、分裂、融合和自噬的動(dòng)態(tài)過程。線粒體通過不斷分裂與融合保持其形態(tài)及分布的穩(wěn)態(tài)。線粒體的分裂與融合主要受一系列線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白的調(diào)控,主要包括：動(dòng)力相關(guān)蛋白1(Drp1),以及它的作用因子包括Fisl、Mff、MID49和MID51等：線粒體融合蛋白Mfnl、Mfn2以及視神經(jīng)萎縮癥蛋白(Opa1)等。這些蛋白通過調(diào)節(jié)線粒體的分裂與融合,在調(diào)控線粒體的形態(tài)與分布,維護(hù)線粒體正常功能的各個(gè)環(huán)節(jié)上發(fā)揮重要的作用。正常情況下,Drp1主要分布于胞漿內(nèi),線粒體分裂時(shí),Drp1被募集到線粒體分裂處,在分裂點(diǎn)周圍形成環(huán)狀螺旋,水解GTP釋放能量,微管環(huán)收縮而切斷線粒體。Opal位于線粒體內(nèi)膜上,具有促進(jìn)線粒體融合的功能,對維持嵴的形態(tài)具有重要作用。研究表明,在多種神經(jīng)退行性疾病中都存在線粒體分裂融合的異常。除了表達(dá)水平的改變,蛋白質(zhì)翻譯后修飾對其發(fā)揮生物活性亦有重要的意義。研究發(fā)現(xiàn)蛋白巰基亞硝基化改變發(fā)生于多種神經(jīng)退行性疾病中。最近研究發(fā)現(xiàn)Drp1蛋白存在多種翻譯后修飾形式,如磷酸化、泛素化、亞泛素化、亞硝基化等。有研究表明在阿爾茲海默癥(Alzheimer disease, AD)中,Drp1的總含量下降,但亞硝基化Drp1含量顯著上升。然而,Drp1亞硝基化與朊病毒病中神經(jīng)元損傷的關(guān)系及其機(jī)制尚不清楚。為探究線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白在朊病毒感染動(dòng)物腦組織中表達(dá)及分布的變化,本研究針對Drp1和Opal兩個(gè)蛋白,通過免疫印跡(Western blot, WB)及免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry, IHC)方法分析其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)、分布；應(yīng)用免疫熒光技術(shù)(Immunofluorescent assay, IFA)分析其在神經(jīng)元細(xì)胞及星形膠質(zhì)細(xì)胞中的定位情況。免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在羊瘙癢因子139A感染終末期小鼠與C57正常小鼠腦組織,263K感染終末期倉鼠與正常倉鼠,利用羊瘙癢因子chandler株感染的SMB-S15細(xì)胞和經(jīng)戊聚糖硫酸酯治療后恢復(fù)的SMB-PS細(xì)胞裂解液經(jīng)顱內(nèi)注射的小鼠相比,Drp1含量均呈降低趨勢,而ME7感染終末期小鼠與C57正常小鼠腦組織相比未發(fā)現(xiàn)明顯變化；感染不同時(shí)間點(diǎn)腦組織中Drp1含量呈降低趨勢,在中期達(dá)到最低,在終末期稍有回升；在ME7感染不同時(shí)間點(diǎn)小鼠腦組織中Drp1含量也呈先降低后升高趨勢。免疫組化結(jié)果顯示139A與ME7感染終末期小鼠大腦皮層與小腦中,Drp1表達(dá)量均降低。羊瘙癢因子不同毒株感染終末期實(shí)驗(yàn)動(dòng)物腦組織與正常對照相比,Opa1含量均呈降低趨勢,且在感染不同時(shí)間點(diǎn),Opa1含量的降低呈時(shí)間依賴性。免疫組化結(jié)果顯示在139A與ME7感染終末期小鼠大腦皮層與小腦中,Opa1表達(dá)量均降低。組織免疫熒光結(jié)果提示Drp1和Opa1在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要分布在神經(jīng)元細(xì)胞。本研究提取了139A與ME7毒株感染小鼠不同時(shí)間點(diǎn)的亞硝基化蛋白,免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,較C57正常小鼠腦組織,139A和ME7感染的小鼠腦組織中亞硝基化的Drpl (SNO-Drpl)的含量明顯升高。139A感染不同時(shí)間點(diǎn)小鼠腦組織中SNO-Drpl含量在感染90天時(shí)已有明顯升高,在120天時(shí)達(dá)到最高,然后逐漸降低,180天時(shí)仍高于正常水平。然而在兩種毒株感染的小鼠腦組織中,均未檢測到亞硝基化形式的Opa1蛋白。本研究結(jié)果表明在朊病毒感染的動(dòng)物模型中,線粒體動(dòng)力學(xué)相關(guān)蛋白的表達(dá)及其亞硝基化修飾水平出現(xiàn)了改變,而這些蛋白含量及亞硝基化修飾含量的改變可能與線粒體形態(tài)、分布及功能障礙直接相關(guān)。這些結(jié)果提示,朊病毒病感染的動(dòng)物腦組織內(nèi)存在線粒體動(dòng)力學(xué)的異常,而線粒體線粒體分裂融合平衡紊亂可能是朊病毒病線粒體改變的過程中的一個(gè)重要環(huán)節(jié),導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)細(xì)胞不可逆的損傷,最終導(dǎo)致朊病毒病的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：中國疾病預(yù)防控制中心
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R742.9

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本文編號：1173612