本文關鍵詞：P物質對星形膠質細胞的活化作用及機制研究

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【摘要】：目的:1.通過離體培養(yǎng)大鼠星形膠質細胞,觀察P物質對星形膠質細胞的活化作用,包括細胞形態(tài)學觀察和對IL-1β和IL-10釋放量的檢測。2.通過P物質作用于離體培養(yǎng)的星形膠質細胞,觀察星形膠質細胞胞內Ca2+濃度的變化,探討活化可能的機制。方法:1.取出生24 h以內的SD乳鼠原代培養(yǎng)星形膠質細胞。將培養(yǎng)的星形膠質細胞分為5組:(1)對照組,細胞孵育全培液;(2)全培液+P物質30 n M組;(3)全培液+P物質100 n M組;(4)全培液+P物質300 n M組;(5)全培液+P物質1000 n M組。各組細胞分別在孵育2 h、6 h、12 h、24 h后收集細胞上清液同時保留細胞,以便進行后續(xù)實驗。2.采用免疫細胞熒光法鑒定GFAP陽性的星形膠質細胞,并觀察P物質孵育后星形膠質細胞在各濃度以及各時間點的形態(tài)變化。3.采用ELISA的方法檢測P物質孵育后星形膠質細胞在各濃度及各時間點釋放IL-1β和IL-10的情況。4.利用比例高內涵成像系統(tǒng)的胞內鈣離子成像技術觀察P物質作用于星形膠質細胞后,其胞內Ca2+濃度的變化。結果:1.培養(yǎng)的星形膠質細胞的鑒定:經免疫細胞熒光法鑒定,培養(yǎng)的細胞為GFAP陽性的星形膠質細胞。用DAPI復染后,證實細胞的純度達95%以上。2.P物質孵育星形膠質細胞后的形態(tài)學改變:以細胞孵育全培液作為對照組。30 n M的P物質孵育星形膠質細胞后的2 h、6 h、12 h、24 h分別與之比較,其形態(tài)幾乎無變化。100 n M的P物質孵育星形膠質細胞后的6 h,部分細胞的胞體開始變大變圓,突起回縮,呈現(xiàn)出活化的形態(tài)學表現(xiàn),且隨著時間的延長,至12 h發(fā)生這種形態(tài)變化的細胞數(shù)目逐漸增多,GFAP的免疫染色也增強。300 n M的P物質孵育星形膠質細胞后的6 h、12 h,呈現(xiàn)活化態(tài)的細胞數(shù)目均較100 n M組增加,此外GFAP的免疫染色也較100 n M組增強。1000 n M的P物質孵育星形膠質細胞后2 h,細胞形態(tài)開始出現(xiàn)上述變化,但至6 h、12 h時GFAP的免疫染色均低于100 n M、300 n M組。100 n M、300 n M組的星形膠質細胞在孵育至24 h時GFAP的免疫染色均較12 h時減弱。3.IL-1β的檢測結果:以細胞孵育全培液組的細胞上清液作為對照組。30 n M的P物質作用于星形膠質細胞后的2 h、6 h、24 h,細胞上清液中的IL-1β含量與對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義,而12 h細胞上清液中的IL-1β含量高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義。100 n M、300 n M的P物質作用于星形膠質細胞后的2 h、6 h、12 h,細胞上清液中的IL-1β含量較對照組增加,差異有統(tǒng)計學意義。而24 h細胞上清液中的IL-1β含量與對照組相比,差異不再有統(tǒng)計學意義。說明P物質作用于星形膠質細胞后,促進其釋放IL-1β,而且具有特定的時間過程。30 n M的P物質促進星形膠質細胞釋放IL-1β的作用在12 h最明顯,至24 h該作用消失。100 n M、300 n M的P物質促進星形膠質細胞釋放IL-1β的作用在2 h開始,在6h作用最強,之后隨著時間的延長,該作用逐漸減弱,至24 h該作用幾乎消失。4.IL-10的檢測結果:以細胞孵育全培液組的細胞上清液作為對照組。30 n M、100 n M、300 n M的P物質作用于星形膠質細胞后的2 h、6 h,細胞上清液中的IL-10含量與對照組相比均減少,差異有統(tǒng)計學意義。30 n M、100 n M、300 n M的P物質作用于星形膠質細胞后的12 h,細胞上清液中的IL-10含量與對照組相比,差異無統(tǒng)計學意義。30 n M、100 n M、300 n M的P物質作用于星形膠質細胞后的24 h,細胞上清液中的IL-10含量與對照組相比增加,且差異有統(tǒng)計學意義。說明P物質作用于星形膠質細胞的最初2 h和6 h內,抑制其釋放IL-10。然而隨著時間的延長,P物質對星形膠質細胞釋放IL-10的抑制作用逐漸減弱。5.胞內鈣離子成像結果:以細胞孵育Hanks液作為對照組,60 m M的kcl用于檢測星形膠質細胞的功能活性。30 n M、100 n M、300 n M、1000 n M的P物質作用于星形膠質細胞后,其胞內鈣離子的濃度與對照組相比均增高,差異有統(tǒng)計學意義。100 n M的P物質作用于星形膠質細胞后,其胞內鈣離子的濃度高于30n M、300 n M、1000 n M的P物質組,差異有統(tǒng)計學意義。300 n M的P物質作用后,星形膠質細胞內鈣離子的濃度高于30 n M、1000 n M的P物質組,差異有統(tǒng)計學意義。而1000 n M的P物質作用后,星形膠質細胞內鈣離子的濃度與30 n M的P物質相比,差異無統(tǒng)計學意義。以上說明,P物質作用于星形膠質細胞后,其胞內鈣離子的濃度升高。其中,以100 n M的P物質作用于星形膠質細胞后引起的胞內鈣離子濃度的升高最為顯著。結論:1.P物質能夠誘導星形膠質細胞呈現(xiàn)出活化態(tài)形態(tài)改變。2.P物質能夠促進星形膠質細胞釋放促炎因子IL-1β,抑制星形膠質細胞釋放抗炎因子IL-10。3.P物質對星形膠質細胞的活化作用可持續(xù)約12 h,至24 h時該作用減弱甚至消失。4.P物質作用于星形膠質細胞后,其胞內鈣離子的濃度升高。100 n M P物質的作用最強。5.P物質誘導星形膠質細胞活化參與疼痛的形成,可能與鈣離子信號轉導途徑的激活以及促進其釋放IL-1β并抑制其釋放IL-10有關。慢性神經病理性疼痛是由軀體感覺神經系統(tǒng)的損傷造成的,其主要表現(xiàn)為異常的痛感受,包括觸誘發(fā)痛(正常非傷害性刺激引起的疼痛)和痛覺過敏(對傷害性刺激過度的痛反應)。慢性疼痛可以持續(xù)數(shù)月,給病人帶來極大痛苦,而臨床上也缺乏有效的治療手段。以往痛覺幾十年的研究取得了巨大的成就,對痛覺的中樞區(qū)域、不同中樞的功能作用及相互聯(lián)系、局部的神經環(huán)路、痛覺感受器的感受機制、參與痛覺傳遞的神經化學物質等有了深入了解。但既往的研究主要關注神經元、神經元構成的環(huán)路及神經遞質的作用。而且基于上述研究結果設計的藥物也是以參與痛覺傳遞的神經元為靶標,雖有一定療效但對慢性疼痛的治療效果并不理想。近些年神經膠質細胞在痛信號產生、傳遞、痛覺形成中的重要作用被逐漸予以重視,已經成為痛覺研究及治療的重要靶點。在神經系統(tǒng)內,神經膠質細胞的數(shù)目遠多于神經元,越來越多的資料顯示膠質細胞在神經生理及病理條件下的功能作用非常重要。研究發(fā)現(xiàn)疼痛模型的動物在慢性疼痛發(fā)生時伴隨有脊髓內神經膠質細胞的活化,表現(xiàn)為胞體肥大,樹突回縮,表面標記蛋白表達增多等現(xiàn)象。鞘內或者全身應用神經膠質細胞代謝抑制劑后,膠質細胞活化減弱,同時慢性疼痛癥狀也得到緩解。這些結果均提示,慢性疼痛的形成與脊髓神經膠質細胞的活化相關。但由于神經系統(tǒng)是由神經元和神經膠質細胞構成的復雜環(huán)路,常規(guī)的疼痛研究模型無法對神經膠質細胞進行深入、系統(tǒng)的觀察,其研究結論也難以排除神經元的影響。因此神經膠質細胞在疼痛信號產生、傳遞過程的作用及機制,如膠質細胞如何活化,活化后如何發(fā)揮作用等并不明確。研究表明,痛模型的大鼠在損傷部位應用局部麻醉藥利多卡因之后脊髓內GFAP的表達減少,而GFAP是星形膠質細胞的特異標記蛋白,這些結果表明,傷害性刺激通過神經元繼而引起中樞神經膠質細胞的激活。提示經神經元向脊髓傳遞的傷害性信號可能是星形膠質細胞活化的啟動因素。外周感覺神經元向脊髓傳遞感覺信號的物質基礎是神經遞質,P物質屬于速激肽家族,是脊髓水平傳遞痛信號特異的神經遞質。NK1受體是P物質的特異性受體,研究發(fā)現(xiàn)NK1受體在神經膠質細胞也有分布。常規(guī)在體實驗結果是基于神經元和膠質細胞網絡所獲得的,這種方式無法明確P物質對星形膠質細胞的直接效應,即P物質是否會對星形膠質細胞產生直接刺激使其激活、激活的途徑是什么,如是否會通過星形膠質細胞合成、釋放細胞因子(包括炎性因子和促炎因子)參與疼痛的傳遞和調節(jié)。因此本研究將采用離體實驗觀察痛特異的神經遞質P物質對星形膠質細胞的活化作用及相關機制。
【學位授予單位】：山西醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R741

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