發(fā)布時(shí)間：2017-10-23 04:28

  本文關(guān)鍵詞：MEF2D在活化的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及作用

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【摘要】：背景帕金森病(Parkinson’s disease,PD)是全球第二大神經(jīng)退行性疾病,在60歲以上老人中,其發(fā)病率達(dá)到了1%[1],該病不僅嚴(yán)重影響了病人的身心健康,而且給家庭及社會(huì)都會(huì)造成巨大的負(fù)擔(dān)。PD表現(xiàn)為慢性進(jìn)展病程,臨床表現(xiàn)多樣,其中靜止性震顫是PD的典型表現(xiàn)。PD的病理表現(xiàn)主要是中腦黑質(zhì)致密部(Substantia nigra pars compacta,SNc)多巴胺能神經(jīng)元缺失,從而引起紋狀體內(nèi)多巴胺含量顯著減少,最終導(dǎo)致發(fā)病[2]。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)的免疫固有細(xì)胞,其在監(jiān)視大腦內(nèi)損傷及病原體侵入方面發(fā)揮重要的免疫學(xué)作用,同時(shí)在維護(hù)神經(jīng)元微環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。小膠質(zhì)細(xì)胞在中腦SNc區(qū)密度明顯高于其他腦區(qū),細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)以及PD病人尸檢腦片均已證明了小膠質(zhì)細(xì)胞在PD發(fā)病過(guò)程中起了重要作用,因此小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)被認(rèn)為是多巴胺能神經(jīng)元的丟失、PD發(fā)病的重要原因之一。肌細(xì)胞增強(qiáng)因子(Myocyte enhancer factor,MEF2)作為機(jī)體內(nèi)重要的轉(zhuǎn)錄因子,其廣泛表達(dá)于各種細(xì)胞,如骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞,免疫細(xì)胞及神經(jīng)元等,通過(guò)調(diào)節(jié)多種基因的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮重要的作用。近年來(lái),不斷的研究表明,MEF2在PD病人中,對(duì)于多巴胺能神經(jīng)元的保護(hù)具有重要作用。此外,已有研究顯示在外周T細(xì)胞中可以檢測(cè)到MEF2D表達(dá),并且MEF2D參與炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)過(guò)程。但是,對(duì)于MEF2D在小膠質(zhì)細(xì)胞中是否表達(dá),以及其在小膠質(zhì)細(xì)胞中的主要作用的研究,目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有這方面的報(bào)道。目的本實(shí)驗(yàn)主要研究轉(zhuǎn)錄因子MEF2D在腦內(nèi)的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況、MEF2D轉(zhuǎn)錄調(diào)控的下游靶基因,以及在小膠質(zhì)細(xì)胞活化時(shí),MEF2D在炎癥反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用與相關(guān)機(jī)制及其對(duì)多巴胺能神經(jīng)元存活的影響。方法首先,觀(guān)察活化的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MEF2D的表達(dá)水平。通過(guò)腹腔注射MPTP,建立C57小鼠急性PD模型,制作SNc區(qū)腦組織切片,使用免疫熒光染色觀(guān)察小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的MEF2D水平。使用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激BV2細(xì)胞系及原代培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞,通過(guò)q PCR及免疫印跡檢測(cè)技術(shù),觀(guān)察不同時(shí)間點(diǎn)下MEF2D的m RNA水平及蛋白水平表達(dá)情況,然后利用EMSA方法檢測(cè)MEF2D的活性變化。其次,探索LPS刺激條件下BV2細(xì)胞系內(nèi)MEF2D的功能作用。通過(guò)q PCR及ELISA實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)LPS刺激條件下BV2內(nèi)的炎癥因子TNF-α的表達(dá)水平及抗炎因子IL-10的表達(dá)水平。通過(guò)Ch IP技術(shù)檢測(cè)MEF2D與IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合的情況。利用含有能特異性干擾MEF2D的sh RNA的重組慢病毒感染BV2,檢測(cè)LPS刺激BV2細(xì)胞條件下,細(xì)胞內(nèi)IL-10及TNF-α的表達(dá)情況。利用BV2細(xì)胞的培養(yǎng)上清建立小膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元的共培養(yǎng)模型,通過(guò)MTT及TUNEL實(shí)驗(yàn)檢測(cè)不同實(shí)驗(yàn)條件下,共培養(yǎng)中的神經(jīng)元存活情況。結(jié)果實(shí)驗(yàn)一:中腦黑質(zhì)區(qū)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MEF2D的表達(dá)變化。通過(guò)建立急性PD模型,可以看到受到刺激后活化的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MEF2D表達(dá)水平明顯升高,同時(shí)SNc區(qū)多巴胺能神經(jīng)元死亡增加。使用LPS刺激BV2細(xì)胞及原代培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞,可以看到,在受到LPS刺激24小時(shí)后,原代細(xì)胞內(nèi)的MEF2D表達(dá)水平明顯升高,而在BV2細(xì)胞內(nèi),LPS刺激18小時(shí)后MEF2D的m RNA水平及蛋白水平均開(kāi)始升高。使用EMSA技術(shù)可以檢測(cè)到LPS刺激24小時(shí)后,BV2內(nèi)的MEF2D蛋白活性水平也是升高的。實(shí)驗(yàn)二:活化的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MEF2D調(diào)控的靶基因的研究。檢測(cè)LPS刺激條件下,BV2的TNF-α及IL-10的表達(dá),可以看到TNF-α表達(dá)水平在2小時(shí)達(dá)到最高,而IL-10的表達(dá)從刺激后18小時(shí)開(kāi)始升高,且其升高趨勢(shì)和MEF2D的變化是相符合的。Ch IP實(shí)驗(yàn)顯示,IL-10是MEF2D調(diào)節(jié)的下游因子。使用慢病毒干擾BV2內(nèi)MEF2D的表達(dá),免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾效率符合實(shí)驗(yàn)要求。干擾MEF2D后,LPS刺激后BV2內(nèi)IL-10的表達(dá)水平及分泌水平均顯著降低,而TNF-α的m RNA表達(dá)水平明顯升高。實(shí)驗(yàn)三:活化的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MEF2D對(duì)于多巴胺能神經(jīng)元存活的影響用培養(yǎng)BV2細(xì)胞的上清液培養(yǎng)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞系SN4741細(xì)胞,建立共培養(yǎng)模型。干擾BV2細(xì)胞內(nèi)MEF2D的表達(dá)或者利用IL-10中和抗體阻斷IL-10的功能,均能夠提高LPS刺激后BV2細(xì)胞培養(yǎng)上清液的神經(jīng)元毒性,誘導(dǎo)更多的神經(jīng)元凋亡。結(jié)論我們的研究首次揭示了MEF2D在小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)表達(dá),其表達(dá)水平在小膠質(zhì)細(xì)胞活化后明顯升高,升高的MEF2D同時(shí)伴隨著神經(jīng)炎癥因子的表達(dá)降低及抗炎因子的表達(dá)升高,通過(guò)分子生物學(xué)及細(xì)胞生物學(xué)方法我們發(fā)現(xiàn)MEF2D直接調(diào)控了抗炎因子IL-10的表達(dá)。從而闡明了一個(gè)全新的小膠質(zhì)細(xì)胞活化后炎癥的發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)過(guò)程:小膠質(zhì)細(xì)胞活化引起了MEF2D水平的升高,MEF2D調(diào)節(jié)IL-10基因的轉(zhuǎn)錄過(guò)程,從而使其表達(dá)及分泌增多,升高的抑炎因子抑制了小膠質(zhì)細(xì)胞分泌炎性因子,明確了MEF2D可決定小膠質(zhì)細(xì)胞M1和M2表型轉(zhuǎn)化、改變微環(huán)境、調(diào)節(jié)神經(jīng)元應(yīng)激反應(yīng),為PD的治療提供了新的研究靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：MEF2D IL-10 小膠質(zhì)細(xì)胞 神經(jīng)炎癥 帕金森病
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R742.5
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-13
• 前言13-14
• 文獻(xiàn)回顧14-25
• 實(shí)驗(yàn)一 中腦黑質(zhì)區(qū)活化的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MEF2D的表達(dá)變化25-44
• 1 材料25-27
• 2 方法27-38
• 3 結(jié)果38-42
• 4 討論42-44
• 實(shí)驗(yàn)二 活化的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MEF2D調(diào)控的靶基因的研究44-56
• 1 材料44-46
• 2 方法46-51
• 3 結(jié)果51-55
• 4 討論55-56
• 實(shí)驗(yàn)三 活化的小膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)MEF2D對(duì)于多巴胺能神經(jīng)元存活的影響56-61
• 1 材料56-57
• 2 方法57-58
• 3 結(jié)果58-60
• 4 討論60-61
• 小結(jié)61-62
• 參考文獻(xiàn)62-78
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果78-79
• 致謝79-80

【相似文獻(xiàn)】

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6 趙敏;袁云;趙培園;李t，

本文編號(hào)：1081627