本文關(guān)鍵詞：BMSCs移植治療帕金森病細(xì)胞學(xué)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究

  更多相關(guān)文章： GFP大鼠 帕金森病 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 移植 星形膠質(zhì)細(xì)胞

【摘要】：帕金森病(Parkinsons'disease, PD)是常見(jiàn)于中老年人的一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病,嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。鑒于PD發(fā)病的主要病理機(jī)制和干細(xì)胞研究的深入,細(xì)胞移植治療有望成為治療該病的理想方法之一,但是細(xì)胞移植治療的機(jī)制尚未明確。本實(shí)驗(yàn)以轉(zhuǎn)綠色熒光蛋白(GFP)基因大鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)作為示蹤細(xì)胞,探討外源細(xì)胞在治療模型大鼠時(shí),在腦內(nèi)的存活、遷移及分化情況,并結(jié)合大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)纖維蛋白(GFAP)的表達(dá)變化,探究星形膠質(zhì)細(xì)胞(AST)在治療PD的作用,為研究臨床PD的細(xì)胞移植治療機(jī)理提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。實(shí)驗(yàn)一轉(zhuǎn)GFP基因大鼠BMSCs作為示蹤細(xì)胞在移植治療帕金森病研究中的應(yīng)用采用立體定位法單側(cè)紋狀體內(nèi)單點(diǎn)注射6-羥多巴胺(6-OHDA)制備PD大鼠模型,術(shù)后以經(jīng)典的阿撲嗎啡(APO)誘導(dǎo)大鼠的轉(zhuǎn)圈數(shù)為指標(biāo)進(jìn)行行為學(xué)檢測(cè),篩選成功PD大鼠模型。取轉(zhuǎn)GFP基因大鼠的BMSCs,將純化的BMSCs定位移植到PD模型大鼠損毀側(cè)紋狀體內(nèi),移植后2周起用APO誘導(dǎo)大鼠轉(zhuǎn)圈行為,檢測(cè)細(xì)胞移植對(duì)PD模型大鼠的行為改善情況；在熒光顯微鏡下觀察實(shí)驗(yàn)大鼠的腦組織切片,追蹤外源GFP大鼠BMSCs在受體腦內(nèi)的存活、遷移情況；并以免疫組化技術(shù)檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的特異性蛋白——酪氨酸羥化酶(TH)的表達(dá),研究分化規(guī)律。成功PD大鼠的轉(zhuǎn)圈數(shù)為10.89±1.08 r/min,轉(zhuǎn)GFP基因大鼠的BMSCs移植腦內(nèi)損毀部位后,從第2周開(kāi)始,旋轉(zhuǎn)圈數(shù)逐漸減少,到第8周降至5.86±1.15 r/min。細(xì)胞移植后,可在紋狀體內(nèi)見(jiàn)到GFP標(biāo)記的外源細(xì)胞,其至少可存活6周；移植后部分細(xì)胞向周圍遷移并有一定的走向,可遷移到大鼠腦內(nèi)廣泛區(qū)域；移植的BMSCs形態(tài)上多數(shù)呈現(xiàn)分化形態(tài),在移植后6周,熒光免疫組化檢測(cè)除見(jiàn)到GFP細(xì)胞的TH陽(yáng)性表達(dá),在移植針道周圍還見(jiàn)到大量的內(nèi)源性神經(jīng)細(xì)胞出現(xiàn)TH陽(yáng)性表達(dá),即BMSCs在紋狀體內(nèi)能定向分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,并能夠使殘存的多巴胺(DA)能神經(jīng)元功能恢復(fù)。研究結(jié)果顯示BMSCs移植技術(shù),對(duì)改善PD模型大鼠的行為有明顯效果,提示可能機(jī)制是外源BMSCs在腦內(nèi)經(jīng)誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元,部分替代了損毀的多巴胺能神經(jīng)元的功能；移植的外源BMSCs通過(guò)產(chǎn)生某些營(yíng)養(yǎng)因子,有效地恢復(fù)模型動(dòng)物中DA神經(jīng)元的功能或使內(nèi)源性更多的神經(jīng)元樣細(xì)胞特異化為合成多巴胺的細(xì)胞,從而改善PD模型的癥狀。GFP轉(zhuǎn)基因大鼠的BMSCs由于自發(fā)熒光,移植后方便觀察外源細(xì)胞在受體腦內(nèi)的存活、遷移和分化規(guī)律,是細(xì)胞移植研究中具有廣泛運(yùn)用前景的示蹤細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)二移植BMSCs對(duì)帕金森病模型大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)的影響本研究通過(guò)檢測(cè)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá),探究腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞(AST)在BMSCs移植治療PD中的功能。實(shí)驗(yàn)分別提取正常大鼠、PD模型大鼠和BMSCs移植治療4周及8周大鼠腦的總RNA和蛋白,再以熒光定量PCR和western blot方法測(cè)定腦內(nèi)GFAP的mRNA及蛋白的含量,對(duì)比分析模型及治療前后mRNA表達(dá)水平的變化與蛋白表達(dá)水平變化的聯(lián)系,同時(shí)結(jié)合酪氨酸羥化酶(TH)的蛋白表達(dá)水平及熒光免疫組化檢測(cè)大鼠腦組織內(nèi)TH的表達(dá)變化,從而直觀地了解大鼠腦內(nèi)多巴胺能神經(jīng)元的變化與AST的關(guān)系。結(jié)果顯示,模型大鼠損毀側(cè)腦紋狀體內(nèi)GFAP mRNA的表達(dá)水平是正常大鼠的1.33倍,GFAP蛋白表達(dá)也高于正常鼠,但是TH蛋白含量明顯減少；BMSCs移植治療后,腦內(nèi)GFAP mRNA的表達(dá)逐漸減少,術(shù)后4周的大鼠原損毀側(cè)腦的表達(dá)量是對(duì)照模型鼠的0.63倍,GFAP蛋白卻增加,TH蛋白表達(dá)也增加；術(shù)后8周大鼠原損毀側(cè)腦GFAP mRNA的表達(dá)是對(duì)照模型鼠的0.30倍,GFAP蛋白亦減少,TH蛋白表達(dá)增加,最后均接近于正常大鼠腦內(nèi)蛋白的表達(dá)。熒光免疫組化法,可見(jiàn)外源細(xì)胞周圍TH含量明顯增多,代替多巴胺能神經(jīng)元的神經(jīng)元樣細(xì)胞也較模型大鼠增多。BMSCs移植治療PD大鼠模型的過(guò)程中,正常動(dòng)物腦內(nèi)GFAP免疫組化表達(dá)陰性,但在制備PD模型的過(guò)程中,星形膠質(zhì)細(xì)胞活化,并出現(xiàn)GFAP的增強(qiáng)表達(dá),成為反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞,而損傷修復(fù)后GFAP的表達(dá)又呈陰性。GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的獨(dú)有標(biāo)志,因此,研究星形膠質(zhì)細(xì)胞在治療帕金森大鼠模型研究中的變化對(duì)探究帕金森治療機(jī)制有重要意義。作為支撐性細(xì)胞,能準(zhǔn)確引導(dǎo)神經(jīng)元遷移到腦內(nèi)損傷部位,并且分泌出大量的營(yíng)養(yǎng)因子,促進(jìn)DA神經(jīng)元的生成而修復(fù)黑質(zhì)-紋狀體DA神經(jīng)通路,其中最為重要的營(yíng)養(yǎng)因子GFAP,對(duì)脊椎動(dòng)物有強(qiáng)烈的保護(hù)作用,并且在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中行使重要功能。因此AST為外源細(xì)胞在腦內(nèi)的遷移作出巨大的貢獻(xiàn),為研究BMSCs移植治療PD的機(jī)理研究提供新的思路。
【關(guān)鍵詞】：GFP大鼠 帕金森病 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 移植 星形膠質(zhì)細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：揚(yáng)州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R742.5
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• Abstract5-9
• 符號(hào)說(shuō)明9-10
• 第一部分 文獻(xiàn)綜述10-29
• 第一章 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞及其移植治療帕金森病的研究進(jìn)展10-17
• 1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的概述10-14
• 2 帕金森病的概述14-15
• 3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療帕金森病的機(jī)制研究15-17
• 第二章 星形膠質(zhì)細(xì)胞在治療PD中的應(yīng)用與GFAP檢測(cè)的研究進(jìn)展17-22
• 1 星形膠質(zhì)細(xì)胞作用研究17-19
• 2 GFAP的檢測(cè)方法19-22
• 參考文獻(xiàn)22-29
• 第二部分 研究論文29-60
• 第一章 轉(zhuǎn)GFP基因大鼠BMSCs作為示蹤細(xì)胞在移植治療帕金森病研究中的應(yīng)用29-44
• 1 材料與方法29-31
• 2 實(shí)驗(yàn)方法31-35
• 3 結(jié)果35-41
• 4 討論41-44
• 第二章 移植BMSCs對(duì)帕金森病模型大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP表達(dá)的影響44-60
• 1 實(shí)驗(yàn)材料44-46
• 2 實(shí)驗(yàn)方法46-51
• 3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-57
• 4 討論57-60
• 全文小結(jié)60-61
• 參考文獻(xiàn)61-63
• 致謝63-64
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄64-65

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本文編號(hào)：1023258