本文關鍵詞：IGF-Ⅰ、醛固酮對成纖維細胞的作用及對彈性蛋白表達的調節(jié)及其機制探討

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【摘要】：成纖維細胞是皮膚真皮中的主體細胞成分,在皮膚老化過程中扮演著重要的角色。成纖維細胞合成彈性蛋白減少、彈性纖維減少、卷曲,使皮膚彈性下降、松弛,出現(xiàn)皺紋。目的:本課題著眼于與皮膚衰老密切相關的皮膚成纖維細胞,研究IGF-I、醛固酮對皮膚成纖維細胞增殖的影響,同時通過研究IGF-I、醛固酮對皮膚彈性蛋白的合成的影響,探討醛固酮發(fā)揮作用的途徑,觀察醛固酮對IGF-I信號通路的影響、作用靶點,并探討其可能機制。方法:1.MTT法檢測不同時間不同濃度IGF-I對皮膚成纖維細胞增殖的影響,分為調零組、對照組、50ng/ml IGF-I、100ng/ml IGF-I、200ng/ml IGF-I、500ng/ml IGF-I組,連續(xù)觀察12h,24h,48h,72h,96h。2.MTT法檢測不同時間不同濃度醛固酮對皮膚成纖維細胞增殖的影響:調零組、對照組、10nmol/L醛固酮、50nmol/L醛固酮、1μmol/L醛固酮組,連續(xù)觀察12h,24h,48h,72h,96h。3.免疫熒光法檢測不同濃度IGF-I對彈性蛋白的調節(jié):制作細胞爬片,按照50ng/ml IGF-I、100ng/ml IGF-I、200ng/ml IGF-I、500ng/ml IGF-I濃度梯度加藥,并設陰性對照。4.免疫熒光法檢測不同濃度醛固酮對彈性蛋白的調節(jié):按照10nmol/L醛固酮、50nmol/L醛固酮、1μmol/L醛固酮濃度梯度加藥,并設陰性對照。5.免疫熒光法檢測醛固酮對彈性蛋白調節(jié)機理的探討:根據實驗結果篩選出最佳濃度醛固酮,分別與最佳濃度IGF-I、極量IGF-I以結合全部IGF-I受體、醛固酮受體拮抗劑安體舒通共同孵育細胞,并設陰性對照。酪氨酸酶抑制劑分別與最佳濃度的醛固酮、IGF-I作用于細胞,磷脂�；家种苿┓謩e與最佳濃度的醛固酮、IGF-I作用于細胞,并設陰性對照,細胞免疫熒光及共聚焦觀察彈性蛋白的變化。7.Western blot半定量檢測醛固酮對彈性蛋白調節(jié)機理的探討,進一步印證免疫熒光的結果。結果:1.MTT法檢測不同時間不同濃度IGF-I對皮膚成纖維細胞增殖的影響:與對照組相比50ng/ml IGF-I、100ng/ml IGF-I與200ng/ml IGF-I組有明顯差異,大于對照組,P0.05;與50ng/ml IGF-I比較100ng/ml IGF-I與200ng/ml IGF-I組有明顯差異,大于該組,P0.05;100ng/ml IGF-I與200ng/ml IGF-I組間無明顯差異。與對照組比較500ng/ml IGF-I組有明顯差異,小于對照組,P0.05。2.MTT法檢測不同時間不同濃度醛固酮對皮膚成纖維細胞增殖的影響:與對照組相比各時間段50nmol/L醛固酮組及12h、96h10nmol/L醛固酮組有明顯差異,大于對照組,P0.05;各時間段50nmol/L醛固酮組與10nmol/L醛固酮比較有明顯差異,大于該組,P0.05。1μmol/L醛固酮組與對照組比較有明顯差異,小于對照組,P0.05。3.免疫熒光法檢測不同濃度IGF-I對彈性蛋白的調節(jié):50ng/ml IGF-I組、100ng/ml IGF-I組、200ng/ml IGF-I組、與空白對照組比較,隨著IGF-I濃度的增加,成纖維細胞內彈性蛋白的比例逐漸增加,100ng/ml IGF-I組、200ng/ml IGF-I組為最佳濃度組,500ng/ml IGF-I組與空白對照相比較,比例下降。4.免疫熒光法檢測不同濃度醛固酮對彈性蛋白的調節(jié):10nmol/L醛固酮組、50nmol/L醛固酮組、并與空白對照組比較,發(fā)現(xiàn)隨著醛固酮濃度的增加,成纖維細胞內彈性蛋白的比例逐漸增加,50nmol/L醛固酮組為最佳濃度。1μmol/L醛固酮組與空白對照相比較,未見明顯變化。5.免疫熒光法、Western Blot法檢檢測醛固酮對彈性蛋白調節(jié)機理的探討發(fā)現(xiàn):與50nmol/L醛固酮組相比,50nmol/L醛固酮+安體舒通2um/ml組、50nmol/L醛固酮+100ng/ml IGF-I成纖維細胞內彈性蛋白的比例增加,50nmol/L醛固酮+1000ng/ml IGF-I組成纖維細胞內彈性蛋白的比例降低,各組成纖維細胞內彈性蛋白的比例均高于空白細胞組。與空白對照相比,100ng/ml IGF-I+酪氨酸激酶抑制劑組比例增加,余醛固酮50nmol/L+酪氨酸激酶抑制劑1umol/L組、醛固酮50nmol/L+磷脂�；家种苿�1umol/L組、100ng/ml IGF-I+磷脂�；家种苿�1umol/L組未見明顯變化。100ng/ml IGF-I+酪氨酸激酶抑制劑PP210umol/L共同孵育細胞,彈性蛋白的量增多;50nmol/L醛固酮+1000ng/ml IGF-I組、醛固酮50nmol/L+酪氨酸激酶抑制劑1umol/L組、醛固酮50nmol/L+磷脂�；家种苿�1umol/L組、100ng/ml IGF-I+磷脂�；家种苿�1umol/L組彈性蛋白的未見明顯變化。結論:1.IGF-I在50ng/ml-200ng/ml濃度范圍內與皮膚成纖維細胞的增生呈劑量效應關系,且在100ng/ml-200ng/ml濃度時促進增生作用顯著。高濃度IGF-I對細胞增殖有抑制作用。2.50nmol/L醛固酮組促皮膚成纖維細胞增生作用最顯著,高濃度醛固酮1μmol/L對細胞增殖有抑制作用。3.IGF-I在50ng/ml-200ng/ml濃度范圍內隨著濃度增加,能有效促進成纖維細胞彈性蛋白的合成,最佳濃度為100ng/ml-200ng/ml IGF-I;高濃度IGF-I(500ng/ml)有抑制成纖維細胞產生彈性蛋白的作用。4.醛固酮能增加彈性蛋白的合成呈劑量依賴性(最佳濃度為50nmol/L),醛固酮受體抑制劑安體舒通不能消除此作用,提示其發(fā)揮作用是通過非醛固酮受體依賴的途徑。5.醛固酮能明顯增加IGF-I受體酪氨酸磷酸化,而且IGF-I受體酪氨酸激酶抑制劑可以抑制醛固酮誘導的彈性蛋白的合成。因此推斷醛固酮促進彈性蛋白合成是通過一個非醛固酮受體依賴性通路即IGF-I受體信號通路來完成。6.磷脂�；家种苿┛梢韵┕掏癐GF-I對彈性蛋白的影響,提示醛固酮對彈性蛋白的影響不是通過醛固酮受體發(fā)揮作用,而是通過活化IGF-I受體,從而導致下游的PI3激酶/AKT信號系統(tǒng)來完成。由于類固醇激素很容易滲透皮膚,當外用時類固醇透入皮膚,并刺激彈性蛋白的合成對延緩皮膚衰老提供一個新思路。
【關鍵詞】：成纖維細胞 彈性蛋白 醛固酮 IGF-I 細胞信號轉導
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R751
【目錄】：

• 中文摘要3-6
• Abstract6-10
• 縮略語/符號說明10-13
• 前言13-20
• 研究現(xiàn)狀、成果13-18
• 研究目的、方法18-20
• 一、IGF-Ⅰ、醛固酮對成纖維細胞的作用20-36
• 1.1 對象和方法20-27
• 1.1.1 材料20-22
• 1.1.2 皮膚成纖維細胞的培養(yǎng)22-25
• 1.1.3 MTT法檢測不同濃度IGF-Ⅰ對皮膚成纖維細胞增殖的影響25-26
• 1.1.4 MTT法檢測不同濃度醛固酮對皮膚成纖維細胞的影響26-27
• 1.1.5 統(tǒng)計學處理27
• 1.2 結果27-33
• 1.2.1 皮膚成纖維細胞的形態(tài)學觀察27
• 1.2.2 MTT法檢測不同濃度IGF-Ⅰ對皮膚成纖維細胞增殖的影響27-31
• 1.2.3 MTT法檢測不同濃度醛固酮對皮膚成纖維細胞的影響31-33
• 1.3 討論33-34
• 1.4 小結34-36
• 二、免疫熒光法檢測IGF-Ⅰ、醛固酮對彈性蛋白的調節(jié)36-43
• 2.1 材料與方法36-37
• 2.1.1 主要試劑與物品36
• 2.1.2 操作步驟36-37
• 2.2 結果37-41
• 2.2.1 免疫熒光法檢測不同濃度IGF-Ⅰ對彈性蛋白的調節(jié)37-40
• 2.2.2 免疫熒光法檢測不同濃度醛固酮對彈性蛋白的調節(jié)40-41
• 2.3 討論41-43
• 三、免疫熒光法檢測醛固酮對彈性蛋白調節(jié)機理的探討43-51
• 3.1 細胞干預及處理43
• 3.2 細胞免疫熒光及共聚焦觀察43-44
• 3.3 結果44-49
• 3.3.1 醛固酮對彈性蛋白調節(jié)機理的探討 144-46
• 3.3.2 醛固酮對彈性蛋白調節(jié)機理的探討 246-49
• 3.4 討論49-51
• 3.4.1 免疫熒光方法注意點49
• 3.4.2 免疫熒光法檢測醛固酮對彈性蛋白調節(jié)機理的探討發(fā)現(xiàn)49-51
• 四、Western-blot法檢測IGF-Ⅰ、醛固酮對彈性蛋白的調節(jié)51-64
• 4.1 材料與方法51-55
• 4.1.1 主要試劑與物品51-55
• 4.2 細胞干預及處理55
• 4.3 樣品收集55-56
• 4.4 Western bloting檢測56-59
• 4.4.1 配膠56-57
• 4.4.2 SDS-PAGE電泳57
• 4.4.3 轉膜57-58
• 4.4.4 封閉及雜交58
• 4.4.5 化學發(fā)光，顯影及定影58-59
• 4.5 結果59-61
• 4.5.1 Western法檢測不同濃度IGF-Ⅰ、醛固酮對彈性蛋白的調節(jié)59-60
• 4.5.2 IGF-Ⅰ、醛固酮對彈性蛋白調節(jié)機制的探討60-61
• 4.6 討論61-64
• 4.6.1 Western-blot免疫印跡法注意點61-62
• 4.6.2 Western-blot方法檢測醛固酮對彈性蛋白調節(jié)機理的探討發(fā)現(xiàn)62-64
• 全文結論64-67
• 論文創(chuàng)新點67-68
• 參考文獻68-79
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明79-81
• 綜述181-93
• 綜述參考文獻89-93
• 綜述293-100
• 綜述參考文獻97-100
• 致謝100

【共引文獻】

中國博士學位論文全文數(shù)據庫 前2條

1 左宗寶;大鼠脂肪源干細胞注射移植對皮膚組織自然衰老的影響[D];華中科技大學;2014年

2 王春茂;血管緊張素Ⅱ調控基質金屬蛋白酶MMP-2的表達在升主動脈瘤發(fā)病中的機制研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2015年

中國碩士學位論文全文數(shù)據庫 前1條

1 高巖;血清趨化素在慢性心衰患者中的變化及螺內酯的干預治療[D];河北醫(yī)科大學;2013年

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本文編號：891069