發(fā)布時間：2017-09-15 15:18

  本文關(guān)鍵詞：6-姜烯酚通過下調(diào)PKM2的表達(dá)抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移

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【摘要】：[研究背景與目的]腫瘤細(xì)胞無論在缺氧還是有氧的環(huán)境下,都主要通過糖酵解途徑進行代謝供能,這就是所謂的腫瘤有氧糖酵解,即著名的“瓦博格效應(yīng)”。大量研究證實,腫瘤細(xì)胞的瓦博格效應(yīng)與糖酵解途徑中關(guān)鍵酶的異�；罨芮邢嚓P(guān),其中丙酮酸激酶(PK)是糖酵解途徑中最容易發(fā)生異常的關(guān)鍵酶之一。現(xiàn)代研究證實腫瘤細(xì)胞中主要表達(dá)2型丙酮酸激酶(PKM2),其過度活化促進腫瘤糖酵解及腫瘤增殖與轉(zhuǎn)移。已有研究顯示,黑色素瘤具有高度活躍的糖酵解活性,且PKM2的高表達(dá)與黑色素瘤轉(zhuǎn)移及預(yù)后差關(guān)系密切,提示PKM2可能是抑制黑色素瘤生長與轉(zhuǎn)移的潛在靶點。6-姜烯酚(6-Shogaol,6-SHO)是中藥干姜中的一種烷基酚類化合物,是干姜中最主要的活性成分之一,實驗室前期研究發(fā)現(xiàn),6-姜烯酚能抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖,且對黑色素瘤細(xì)胞糖酵解過程具有一定抑制效應(yīng),因此,我們根據(jù)這個現(xiàn)象進行了深入探討,6-姜烯酚是否能夠通過抑制黑色素瘤細(xì)胞的糖酵解從而抑制了黑色素瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移,以進一步揭示6-姜烯酚抗黑色素瘤的分子機制。[實驗內(nèi)容]本研究第一部分從體外細(xì)胞水平,應(yīng)用MTT、劃痕、transwell實驗考察了6-姜烯酚對黑色素瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。第二部分首先通過MTT實驗、葡萄糖攝取、乳酸生成實驗考察了黑色素瘤細(xì)胞與正常皮膚細(xì)胞對糖酵解抑制劑與氧化磷酸化抑制劑的敏感性以及糖酵解水平,初步判斷黑色素瘤的代謝表型；接著考察了6-姜烯酚對黑色素瘤細(xì)胞糖酵解水平的影響；同時應(yīng)用酶活實驗考察了6-姜烯酚對黑色素瘤糖酵解過程中關(guān)鍵限速酶以及代謝產(chǎn)物的影響。第三部分重點探討了6-姜烯酚調(diào)控2型丙酮酸激酶的機制研究,考察了6-姜烯酚對PKM2蛋白水平以及核轉(zhuǎn)位的影響,同時考察了6-姜烯酚對PKM2核內(nèi)調(diào)控蛋白STAT3蛋白表達(dá)以及核轉(zhuǎn)位的影響,并對STAT3下游靶蛋白Cyclin D1、Bcl-xL、MMP-2、MMP-9等表達(dá)進行了驗證。第四部分分別從轉(zhuǎn)移瘤、皮下移植瘤兩種模型考察6-姜烯酚對黑色素瘤體內(nèi)生長與轉(zhuǎn)移的影響,并通過HE、免疫組化考察6-姜烯酚對轉(zhuǎn)移瘤與移植瘤中PKM2、p-STAT3表達(dá)的影響,進一步驗證6-姜烯酚的抗黑色素瘤增殖與轉(zhuǎn)移的效應(yīng)機制。[研究結(jié)果]第一部分結(jié)果顯示,6-姜烯酚能劑量依賴性、時間依賴性的抑制黑色素瘤細(xì)胞(B16F10、A375)的增殖；并能一定程度上抑制黑色素瘤細(xì)胞的遷移與侵襲,初步表明了6-姜烯酚對黑色素瘤增殖、遷移與侵襲的具有抑制效應(yīng)。第二部分結(jié)果顯示黑色素瘤細(xì)胞對糖酵解抑制比較敏感,對氧化磷酸化抑制劑不敏感,且糖酵解水平顯著高于正常皮膚細(xì)胞,初步提示黑色素瘤細(xì)胞是偏糖酵解的代謝表型。應(yīng)用6-姜烯酚干預(yù)后,發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚能抑制黑色素瘤細(xì)胞的糖酵解水平(葡萄糖攝取、乳酸生成),同時酶活實驗發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚對糖酵解途徑中丙酮酸激酶具有一定抑制效應(yīng)。第三部分結(jié)果顯示,黑色素瘤細(xì)胞中PKM2表達(dá)顯著高于正常皮膚,提示黑色素瘤細(xì)胞中PKM2的高度活化。應(yīng)用6-姜烯酚后,能抑制PKM2的蛋白表達(dá)；同時發(fā)現(xiàn)6-姜烯酚能逆轉(zhuǎn)PKM2激動劑對黑色素瘤細(xì)胞遷移與侵襲的促進效應(yīng)；且對PKM2核內(nèi)表達(dá)也有抑制效應(yīng)。進一步實驗發(fā)現(xiàn),6-姜烯酚對受PKM2調(diào)控的STAT3磷酸化有抑制效應(yīng),并能抑制STAT3核內(nèi)磷酸化水平,對STAT3下游靶蛋白也有抑制效應(yīng)。第四部分的轉(zhuǎn)移瘤、皮下移植瘤實驗結(jié)果表明,6-姜烯酚對黑色素瘤生長與轉(zhuǎn)移具有一定的抑制效應(yīng),且能抑制轉(zhuǎn)移瘤與皮下移植瘤中的PKM2、p-STAT3的表達(dá)。[結(jié)論與意義]本課題的實驗結(jié)果表明,干姜中的主要活性物質(zhì)6-姜烯酚能通過抑制腫瘤糖酵解途徑中的PKM2,下調(diào)黑色素瘤細(xì)胞的糖酵解進程,抑制黑色素瘤的增殖與遷移；同時6-姜烯酚能抑制黑色素瘤細(xì)胞中的STAT3活化,并且通過抑制PKM2的核轉(zhuǎn)位,進一步下調(diào)核內(nèi)STAT3的活化程度,從而抑制了黑色素瘤細(xì)胞的遷移與侵襲,發(fā)揮其抗黑色素瘤增殖與轉(zhuǎn)移的效應(yīng)。本研究首次揭示了6-姜烯酚抗黑色素瘤增殖與轉(zhuǎn)移的效應(yīng),并初步從干擾黑色素瘤糖酵解層面闡述了6-姜烯酚抗黑色素瘤增殖與轉(zhuǎn)移的作用機理。同時也為研究中藥,尤其是藥食同源類中藥發(fā)揮其抗腫瘤效應(yīng)提供了一個新的研究思路與切入點。
【關(guān)鍵詞】：6-姜烯酚 黑色素瘤 瓦博格效應(yīng) 腫瘤轉(zhuǎn)移 2型丙酮酸激酶
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-12
• 前言12-16
• 第一部分 6-姜烯酚對于黑色素瘤細(xì)胞增殖與遷移的影響16-23
• 摘要16
• 1.1 實驗材料16-17
• 1.2 實驗方法17-18
• 1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計18
• 1.4 實驗結(jié)果18-21
• 1.5 小結(jié)與討論21-23
• 第二部分 6-姜烯酚對于黑色素瘤細(xì)胞有氧糖酵解的影響23-35
• 摘要23-24
• 2.1 實驗材料24-25
• 2.2 實驗方法25-29
• 2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計29
• 2.4 實驗結(jié)果29-33
• 2.5 小結(jié)與討論33-35
• 第三部分 6-姜烯酚通過干擾2型丙酮酸激酶抑制黑色素瘤細(xì)胞增殖與遷移的機制研究35-54
• 摘要35-36
• 3.1 實驗材料36-38
• 3.2 實驗方法38-42
• 3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計42-43
• 3.4 實驗結(jié)果43-52
• 3.5 小結(jié)與討論52-54
• 第四部分 6-姜烯酚對黑色素瘤實驗性轉(zhuǎn)移與皮下移植瘤的研究54-61
• 摘要54
• 4.1 實驗材料54
• 4.2 實驗方法54-57
• 4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計57
• 4.4 實驗結(jié)果57-59
• 4.5 討論與小結(jié)59-61
• 總結(jié)與展望61-63
• 文獻(xiàn)綜述 M2型丙酮酸激酶在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用研究進展63-69
• 參考文獻(xiàn)69-89
• 英文縮略詞89-90
• 攻讀碩士學(xué)位期間取得的學(xué)術(shù)成果90-91
• 致謝91

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