本文關鍵詞：惡性黑素瘤的轉錄組學及轉移相關分子機制的研究

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【摘要】：研究背景 惡性黑素瘤是一種高度侵襲和高致死率的惡性腫瘤。多發(fā)生于皮膚,占皮膚惡性腫瘤第三位。也可發(fā)生于眼睛、腸道粘膜和顱內等。占皮膚腫瘤死亡人數的80%。近年來,惡性黑素瘤發(fā)病率每年以4-6%速度上升。早期發(fā)現可手術切除，但對已轉移病例，目前無有效治療方法。黑素瘤的形成是一個多步驟、多因素過程，包括眾多基因的改變。從基因組和轉錄組的水平研究參與這些過程中的基因變化和基因表達譜，有助于人們認識黑素瘤的發(fā)生發(fā)展過程。既往的研究基于基因芯片或其他腫瘤研究的數據，很難發(fā)現對惡性黑素瘤轉移起特異作用的基因或潛在未發(fā)現的功能基因。因此獲得惡性黑素瘤的完全基因表達譜尤為重要。 RNA-seq是利用第二代測序技術對轉錄組進行研究的高通量方法，可以對轉錄組進行精確定量分析。我們擬利用RNA-seq的方法對黑素瘤細胞進行全轉錄組范圍基因表達譜的測序和比較分析。比以前的黑素瘤表達譜研究，通量大大提高，，基本可以覆蓋所有表達的基因。因此若比較惡性黑素瘤的轉移和低轉移組織，可能發(fā)現與轉移相關的重要因素。本研究的 目的:1利用高通量測序方法（RNA-seq）獲得惡性黑素瘤的基因表達譜;2建立分析惡性黑素瘤基因差異表達的數學模型;3對所得基因表達譜進行聚類分析和篩選候選基因；4利用功能試驗驗證候選基因的生物學效應。 方法：1利用RNA-seq技術對反映黑素瘤不同狀態(tài)的細胞株：正常黑素細胞株（HEMn-LP）、低轉移性惡性黑素瘤細胞株（A375）和轉移性惡性黑素瘤的胞株（A2058）進行深度測序和基因表達譜分析；2通過IDEG6、DAVID、GO、KEGG和IPA等分析方法對三個細胞系所得基因表達譜進行差異分析;3根據差異基因表達變化的方式和程度建立9種趨勢和41種亞趨勢的數學分析模型；4篩選候選基因并在A375中過表達候選基因，通過遷移及穿透試驗等驗證其生物學活性。 結果：1獲得HEMn-LP、A375、A2058三個細胞株的基因表達譜，2基因表達譜的據類分析表明腫瘤細胞株的基因表達與正常黑素細胞株顯著差異；3腫瘤細胞株染色體9、11、12、14的基因表達與黑素細胞株差異顯著；4scUscU模式中聚集的基因差異表達顯著并與惡性黑素瘤生物功能相關；5候選基因CTGF、Twist1和MAGEA1可提高A375的遷移及穿透力。 結論：1與惡性黑素瘤發(fā)生和轉移相關的基因大多聚集在染色體9、11、12、14上；2我們建立的9類41種亞趨勢的數學模型可用于篩選與惡性黑素發(fā)生和轉移的候選基因；3scUscU中聚集的差異表達基因大多與惡性黑素瘤轉移密切相關。4利用上述分析方法篩選的CTGF、Twist1和MAGEA1作為候選基因在A375中過表達可明顯提高惡性黑素瘤細胞的遷移和轉移能力。
【關鍵詞】：惡性黑素瘤 腫瘤轉移 基因表達測序 基因表達模式
【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 中文摘要7-9
• Abstract9-11
• 縮略詞11-12
• 第一部分 惡性黑素瘤轉錄組研究12-45
• 前言12-15
• 1.方法15-27
• 1.1 實驗材料15
• 1.2 主要儀器與設備15-16
• 1.3 主要試劑與耗材16
• 1.4 實驗方法16-23
• 1.4.1 細胞培養(yǎng)16-18
• 1.4.2 總 RNA 提取18-19
• 1.4.3 mRNA 分離19-20
• 1.4.4 SOLiD 轉錄組 cDNA 文庫的構建20-22
• 1.4.5 SOLiD 上機前準備22-23
• 1.5 數據分析方法23-27
• 1.5.1 SOLiD 測序序列與基因組對比23-24
• 1.5.2 構建 Junction 數據集24
• 1.5.3 基因表達豐富度的統計24-25
• 1.5.4 差異表達基因的鑒定和功能分析25
• 1.5.5 差異表達基因在染色體上的分布研究25-26
• 1.5.6 差異表達基因調控網絡和細胞轉導通路的構建26
• 1.5.7 基因差異表達數學模型的構建26-27
• 2.結果27-40
• 2.1 mRNA 轉錄組文庫的構建27
• 2.2 RNA-seq 數據質量控制研究27-28
• 2.3 RNA-seq 數據分析28-30
• 2.4 基因表達豐度的統計30-31
• 2.5 A375 和 A2058 細胞株差異表達基因的分析31-33
• 2.6 惡性黑素瘤相關基因的染色體分布特點33-34
• 2.7 與惡性黑素瘤轉移相關的信號轉導通路34-36
• 2.8 與惡性黑素瘤發(fā)生、轉移相關的基因表達模式36-37
• 2.9 鑒別 scUscU, scUscD1 和 scDscU2 的網絡37-40
• 3. 討論40-44
• 4. 結論44-45
• 第二部分 惡性黑素瘤轉移相關分子機制的研究45-69
• 前言45-47
• 1.材料與方法47-58
• 1.1 細胞和質粒47
• 1.2 實驗試劑和儀器47-50
• 1.2.1 實驗試劑和耗材47-48
• 1.2.2 試劑盒48-49
• 1.2.3 常用溶液和培養(yǎng)基49
• 1.2.4 實驗儀器49-50
• 1.3 實驗方法50-58
• 1.3.1 基因過表達載體構建50-52
• 1.3.2 化學轉染(Lipofeactmine 2000)52
• 1.3.3 免疫印跡技術(Western blot)52-54
• 1.3.4 實時定量 PCR (Quantitative Real time PCR)54-56
• 1.3.5 細胞培養(yǎng)56-57
• 1.3.6. 細胞遷移實驗57
• 1.3.7. 細胞侵襲實驗57-58
• 2. 結果58-63
• 2.1 與惡性黑素瘤轉移相關的候選基因的確定58-59
• 2.2 候選基因的 real time-PCR 驗證59-60
• 2.3 CTGF、Twist1、MAGEA1 過表達可促進 A375 遷移和侵襲60-63
• 3. 討論63-68
• 4. 結論68-69
• 文獻綜述69-75
• 參考文獻75-80
• 研究生期間發(fā)表論文80-82
• 致謝82-83

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前5條

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本文編號：846932