本文關(guān)鍵詞：Prdx2保護(hù)真皮間充質(zhì)干細(xì)胞抑制皮膚衰老的機(jī)制研究

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【摘要】：Prdx2(Peroxiredoxin Ⅱ)是一種廣泛存在于機(jī)體組織細(xì)胞中的過(guò)氧化物還原酶,具有及時(shí)清除體內(nèi)較低濃度活性氧(ROS)的作用。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的研究發(fā)現(xiàn),Prdx2基因敲除小鼠的胚胎成纖維細(xì)胞(MEF)表現(xiàn)出嚴(yán)重的細(xì)胞衰老特征,而且Prdx2基因敲除鼠出現(xiàn)了明顯的皮膚衰老癥狀,表現(xiàn)為全層皮膚厚度減少、表皮角質(zhì)層增厚、真皮層明顯變薄,這些現(xiàn)象顯示出了Prdx2在皮膚衰老過(guò)程中可能的重要作用。雖然Prdx2的功能得到了較為廣泛的研究,但是缺失Prdx2引起皮膚衰老的原因和Prdx2在真皮間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)衰老皮膚組織中的作用機(jī)理仍然未知。為了進(jìn)一步探究Prdx2在延緩皮膚衰老和保護(hù)真皮間充質(zhì)干細(xì)胞(DMSCs)中的分子機(jī)制,本實(shí)驗(yàn)利用Prdx2基因敲除模式鼠,研究Prdx2在真皮間充質(zhì)干細(xì)胞延緩皮膚衰老過(guò)程中的作用,闡明Prdx2保護(hù)真皮間充質(zhì)干細(xì)胞防止皮膚提前衰老的分子機(jī)制。首先,在體內(nèi)部分,本實(shí)驗(yàn)利用3月齡(Young)、8月齡(Middle Age)、11月齡(Aged)Prdx2基因敲除型小鼠和野生型小鼠,采用HE染色和Masson膠原染色的方法觀察其皮膚組織變化;通過(guò)背部全層皮膚損傷修復(fù)情況評(píng)估皮膚功能;通過(guò)蛋白免疫印跡(Western Blot)的方法檢測(cè)皮膚組織中與衰老和增殖相關(guān)的蛋白表達(dá)水平。其次,在細(xì)胞部分,本實(shí)驗(yàn)利用流式細(xì)胞術(shù)(FACS)對(duì)真皮間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行鑒定,并檢測(cè)不同代次(Passages)真皮間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期(Cell Cycle)、細(xì)胞凋亡(Apoptosis)水平;利用SA-β-gal染色方法檢測(cè)真皮間充質(zhì)干細(xì)胞衰老情況;利用MTT繪制生長(zhǎng)曲線;利用Western Blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)水平。第三,在分子部分,通過(guò)細(xì)胞免疫熒光染色,通過(guò)核蛋白抽提(Nucleoprotein extraction)和蛋白免疫印跡觀察β-catenin入核水平和其他關(guān)鍵信號(hào)蛋白表達(dá)水平,闡明Prdx2調(diào)控經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)的分子機(jī)制。在體內(nèi)水平HE染色及Masson膠原染色結(jié)果顯示隨著小鼠月齡的增加真皮層厚度逐漸減少,且相同月齡的Prdx2基因敲除型小鼠的真皮厚度小于野生型小鼠的真皮層厚度;皮膚損傷愈合實(shí)驗(yàn)顯示基因敲除型小鼠背部全層皮膚傷口愈合速度慢于野生型小鼠;Western Blot結(jié)果顯示隨著小鼠月齡的增加皮膚組織中p21、p16的表達(dá)量增加且相同月齡敲除型高于野生型,stat3的磷酸化水平和PCNA表達(dá)量降低且敲除型低于野生型。在細(xì)胞水平,隨著小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞的代次增加,細(xì)胞周期發(fā)生了G0/G1期阻滯且相同代次敲除型阻滯比例更高;SA-β-gal染色結(jié)果顯示隨著代次增加細(xì)胞衰老比例增加,相同代次敲除型小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞細(xì)胞衰老比例明顯高于野生型;增殖曲線顯示,3P時(shí)兩基因型小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞增殖速度無(wú)差異,隨代次增多敲除型增殖速度明顯低于野生型;Western Blot結(jié)果顯示隨代次增加p21、p16的表達(dá)量增加且相同代次敲除型高于野生型stat3的磷酸化水平和PCNA表達(dá)量降低且敲除型低于野生型。在分子水平,細(xì)胞免疫熒光染色和Western Blot結(jié)果顯示,Prdx2基因敲除型小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞的β-catenin入核增加,GSK3β(Ser9)和Akt磷酸化水平增加。以上結(jié)果表明,Prdx2可以調(diào)控經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)通路保護(hù)小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞使其維持正常的數(shù)量和功能,Prdx2的缺失會(huì)導(dǎo)致Wnt/β-catenin信號(hào)通路的異常激活,從而造成真皮間充質(zhì)干細(xì)胞的提前衰老,進(jìn)而導(dǎo)致了Prdx2敲除型小鼠皮膚的提前衰老和傷口愈合能力的下降。
【關(guān)鍵詞】：真皮間充質(zhì)干細(xì)胞 皮膚衰老 細(xì)胞衰老 過(guò)氧化物還原酶Ⅱ 基因敲除小鼠
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R751
【目錄】：

• 摘要8-10
• 英文摘要10-12
• 1 文獻(xiàn)綜述12-22
• 1.1 引言12
• 1.2 皮膚衰老的研究進(jìn)展12-18
• 1.2.1 干細(xì)胞與皮膚衰老12-15
• 1.2.2 活性氧與皮膚衰老15-16
• 1.2.3 信號(hào)通路與皮膚衰老16-18
• 1.3 Prdx2研究進(jìn)展18-20
• 1.3.1 Prdx2基因功能研究18-19
• 1.3.2 Prdx2與Wnt信號(hào)19-20
• 1.4 研究意義20-22
• 2 材料與方法22-30
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料22-25
• 2.1.1 Prdx2基因敲除小鼠22
• 2.1.2 主要試劑和儀器22-25
• 2.2 試驗(yàn)方法25-30
• 2.2.1 小鼠基因型鑒定25-26
• 2.2.2 小鼠皮膚組織H&E染色26
• 2.2.3 小鼠皮膚組織Masson膠原染色26
• 2.2.4 免疫印跡（Western Blot）檢測(cè)蛋白表達(dá)變化26-27
• 2.2.5 小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞提取27
• 2.2.6 小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定27
• 2.2.7 細(xì)胞周期檢測(cè)27-28
• 2.2.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè)28
• 2.2.9 生長(zhǎng)曲線繪制28
• 2.2.10 SA-β-gal染色28
• 2.2.11 細(xì)胞免疫熒光染色28-30
• 3 結(jié)果與分析30-42
• 3.1 Prdx2缺失導(dǎo)致小鼠皮膚提前衰老30-34
• 3.1.1 Prdx2基因敲除小鼠與野生型小鼠皮膚組織染色30-31
• 3.1.2 Prdx2基因敲除小鼠與野生型小鼠皮膚組織相關(guān)蛋白表達(dá)檢測(cè)31-33
• 3.1.3 Prdx2敲除型小鼠與野生型小鼠皮膚全層傷口愈合速度檢測(cè)33-34
• 3.2 小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞鑒定34-35
• 3.3 Prdx2缺失導(dǎo)致小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞提前衰老35-39
• 3.3.1 連續(xù)傳代的兩種基因型小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞周期檢測(cè)36-37
• 3.3.2 連續(xù)傳代的兩種基因型小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖能力37-38
• 3.3.3 連續(xù)傳代的兩種基因型小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞的細(xì)胞凋亡水平38
• 3.3.4 連續(xù)傳代的兩種基因型小鼠真皮間充質(zhì)干細(xì)胞的衰老水平38-39
• 3.4 Prdx2缺失導(dǎo)致真皮間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)典Wnt/β-catenin信號(hào)異常激活39-42
• 3.4.1 Prdx2敲除導(dǎo)致Wnt/β-catenin累積并入核39-40
• 3.4.2 Prdx2敲除導(dǎo)致GSK3β活性降低40-42
• 4 討論42-46
• 5 結(jié)論46-48
• 參考文獻(xiàn)48-54
• 致謝54-56
• 附錄56-60
• 個(gè)人簡(jiǎn)介60

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本文編號(hào)：800362