本文關(guān)鍵詞：血根堿引起的藥物—藥物相互作用及抗惡性黑素瘤轉(zhuǎn)移的研究

  更多相關(guān)文章： 血根堿 藥物-藥物相互作用 侵襲 轉(zhuǎn)移 三維培養(yǎng)

【摘要】：背景：血根堿是一種具有抗微生物、抗炎等多種生物學(xué)活性的生物堿，因其對(duì)多種人類腫瘤細(xì)胞系有較強(qiáng)的抑制作用而被推薦為抗癌候選藥物。鑒于對(duì)中藥單體的毒性和藥效活性評(píng)價(jià)是其成藥的兩大前提因素，因此本研究擬對(duì)血根堿的毒性和抗癌活性進(jìn)行深入的探討。藥物的毒副作用已經(jīng)被大量文獻(xiàn)報(bào)道，其產(chǎn)生毒性存在種屬差異。血根堿對(duì)細(xì)胞色素P450酶的抑制與其毒性相關(guān)。惡性黑素瘤是高度惡性皮膚腫瘤，可發(fā)生早期血行轉(zhuǎn)移，腦和肺等是其主要侵襲、轉(zhuǎn)移器官，該類疾病手術(shù)治療困難，且預(yù)后極差。惡性黑素瘤惡性程度高、轉(zhuǎn)移發(fā)生早。理想的抗惡性黑素瘤的藥物最好既能有效的抑制原發(fā)腫瘤的增殖，又能抑制其轉(zhuǎn)移。目前用于抗腫瘤藥物篩選的體外模型主要是平面培養(yǎng)，即二維模型。細(xì)胞二維培養(yǎng)模型存在一些缺陷：缺乏真實(shí)的腫瘤組織的微環(huán)境，缺少細(xì)胞外基質(zhì)的支持，腫瘤細(xì)胞的貼壁生長使其喪失了某些生物學(xué)特性。 目的： 1.研究血根堿是否會(huì)誘發(fā)經(jīng)CYP酶抑制的藥物-藥物相互作用。 2.研究血根堿是否能夠抑制人惡性黑色素瘤細(xì)胞株451LU的粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移能力。 3.建立一種人惡性黑色素瘤細(xì)胞株451LU的三維培養(yǎng)模型，對(duì)其形態(tài)學(xué)及功能學(xué)進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，并在此基礎(chǔ)上對(duì)血根堿的抗腫瘤活性再次進(jìn)行評(píng)價(jià)。 方法： 1.通過CYP探針底物反應(yīng)，對(duì)血根堿對(duì)CYP酶各個(gè)亞型的抑制能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，繼而通過單點(diǎn)失活實(shí)驗(yàn)、抑制動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行可逆和基于時(shí)間依賴的抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)測定，根據(jù)FDA推薦的預(yù)測公式推導(dǎo)出體內(nèi)血根堿藥物-藥物相互作用程度的預(yù)測。 2.用SRB法檢測不同濃度血根堿對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞細(xì)胞活力的影響，通過Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測目標(biāo)濃度血根堿對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞細(xì)胞活力的影響。通過transwell腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)、基質(zhì)-細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)、內(nèi)皮細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)來檢測血根堿對(duì)惡性黑色素瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移、粘附及對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用。通過real time PCR，Western blot來檢測腫瘤轉(zhuǎn)移、粘附、血管生成相關(guān)基因和蛋白的影響。Western Blot法檢測血根堿對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞的FAK信號(hào)通路的影響。 3.將人惡性黑色素瘤細(xì)胞株451LU種植于鼠尾膠原中，使細(xì)胞在三維立體條件下生長。通過組織學(xué)染色、細(xì)胞活性分析及免疫熒光染色對(duì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過DNA含量的測定來反映不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞增殖的情況，通過real time PCR檢測相關(guān)基因表達(dá)量的差異。通過MTT法評(píng)價(jià)四種抗癌藥物對(duì)惡性黑素瘤細(xì)胞的細(xì)胞活力的影響。 結(jié)果： 1.對(duì)血根堿是否會(huì)引經(jīng)CYP酶抑制的藥物-藥物相互作用進(jìn)行研究首先考察80μM血根堿對(duì)CYP各個(gè)亞型催化的探針反應(yīng)的抑制作用，結(jié)果顯示對(duì)于CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4,血根堿對(duì)其活性的抑制超過50%，進(jìn)一步對(duì)其抑制的半數(shù)抑制濃度(IC50)進(jìn)行測定。血根堿對(duì)其催化的反應(yīng)產(chǎn)生濃度依賴型的抑制，IC50值分別為4.5、10.2、7.2和3.4μM。選擇不同血根堿濃度和探針底物濃度對(duì)抑制CYP1A2，CYP2C8，CYP2C9，CYP34的可逆抑制類型和抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行了測定。用Lineweaver-Burk作圖方法來判斷可逆抑制類型，用二次作圖來計(jì)算抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明，血根堿對(duì)CYP1A2, CYP3A4和CYP2C9的抑制類型屬于競爭性抑制，而對(duì)CYP2C8屬于非競爭性抑制。用Lineweaver-Burk作圖中的每條線的斜率對(duì)血根堿濃度作圖，求得可逆抑制常數(shù)Ki，CYP1A2、CYP2C8、CYP2C9、CYP3A4Ki值分別為2.7、8.9、3.8和2.0μM。在單點(diǎn)失活實(shí)驗(yàn)中，加入NADPH預(yù)孵后的血根堿對(duì)CYP1A2、CYP3A4活性的抑制百分比分別增加了25.5%和20.3%，對(duì)其它CYP亞型的抑制增加的百分比均小于15%。研究發(fā)現(xiàn)，血根堿對(duì)CYP1A2，CYP3A4催化的反應(yīng)體現(xiàn)出時(shí)間依賴和NADPH依賴的抑制行為。其對(duì)兩酶的TDI抑制動(dòng)力學(xué)參數(shù)KI/kinactvalues分別為13.3/0.087和5.58/0.029min-1μM-1. 2.研究血根堿是否能夠抑制人惡性黑色素瘤細(xì)胞株451LU的粘附、侵襲、轉(zhuǎn)移能力0.02-50μM血根堿可以顯著抑制人惡性黑素瘤451-LU細(xì)胞的細(xì)胞活力，為避免細(xì)胞活力因素對(duì)后續(xù)實(shí)驗(yàn)的影響，分別選擇安全濃度、低毒濃度和80%細(xì)胞活力的三個(gè)濃度，即1μM、1.5μM、2μM三個(gè)濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Annexin V和PI雙染流式細(xì)胞術(shù)可見1-2μM血根堿對(duì)451-LU細(xì)胞活力無明顯的影響。1-2μM血根堿對(duì)451-LU細(xì)胞粘附能力均有一定的抑制作用�？梢砸种�451-LU細(xì)胞與基質(zhì)膠原的粘附作用，且抑制能力呈時(shí)間、濃度依賴性。血根堿可以抑制451-LU細(xì)胞侵襲、遷移的能力，但各組間未見顯著差異。通過SRB方法檢測血根堿對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果顯示，nM級(jí)別的血根堿可對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞出現(xiàn)較強(qiáng)的抑制作用。分別選取與腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)的三組蛋白，MMP-2、MMP-2、ICAM-1、VCAM-1、EGF和VEGF-A，將原位惡性黑素瘤WM35與轉(zhuǎn)移株451LU細(xì)胞中各蛋白mRNA的表達(dá)情況通過realtime-PCR的手段進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示ICAM-1、MMP-2、EGF和VEGF-A的mRNA表達(dá)存在顯著的增加。1-2μM血根堿均可以抑制ICAM-1，MMP-2, EGF和VEGF-A的mRNA表達(dá)。血根堿同樣可以抑制ICAM-1，MMP-2蛋白的表達(dá)，可以下調(diào)FAK及P-FAK的表達(dá)。 3.人惡性黑素瘤細(xì)胞株451LU三維培養(yǎng)模型傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)中，3天左右細(xì)胞出現(xiàn)增殖，5天左右開始出現(xiàn)凋亡，到第7天已經(jīng)大部分凋亡，而三維培養(yǎng)條件下，451LU細(xì)胞呈腫瘤團(tuán)狀增殖，至14天仍可見良好細(xì)胞活性。與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)相比，三維培養(yǎng)條件下的細(xì)胞增殖能力顯著增加。顯微鏡下可見細(xì)胞呈球團(tuán)狀生長，晚期(14天)腫瘤團(tuán)中央可出現(xiàn)缺氧壞死，與在體腫瘤類似。使用MTT的方法對(duì)二維培養(yǎng)條件和三維培養(yǎng)條件下阿霉素、長春堿、紫杉醇和血根堿的抗451LU活性進(jìn)行檢測，在三維培養(yǎng)條件下，阿霉素、長春堿和血根堿各組的IC50值存在不同程度的提升，而紫杉醇組仍舊未檢測到抗癌活性。在三維培養(yǎng)條件下，分別選取在二維培養(yǎng)條件下出現(xiàn)顯著差異的ICAM-1、MMP-2、EGF和VEGF-A，及其在惡性黑素瘤中存在高表達(dá)的WT1、BRAF-V600E，與藥物吸收相關(guān)的P-gp，與腫瘤細(xì)胞脫落相關(guān)的KLK7，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在三維培養(yǎng)條件下，MMP2、ICAM-1、BRAF-V600E、p-gp的mRNA表達(dá)出現(xiàn)顯著的增加。 結(jié)論： 1.血根堿對(duì)CYP1A2、 CYP3A4和CYP2C9產(chǎn)生了競爭性的可逆抑制作用，，對(duì)CYP2C8產(chǎn)生了非競爭性的可逆抑制作用。血根堿還對(duì)CYP1A2和CYP3A4產(chǎn)生了時(shí)間依賴性的抑制。血根堿與CYP1A2、CYP3A4、CYP2C8和CYP2C9的底物共用時(shí)可能誘發(fā)嚴(yán)重藥物-藥物相互作用。 2.血根堿可以顯著抑制人惡性黑素瘤451LU細(xì)胞增殖能力。同時(shí)，血根堿可抑制黑素瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及血管生成的能力，其抑制侵襲轉(zhuǎn)移的能力可能與下調(diào)MMP2、ICAM1、VEGF、EGF的基因、蛋白表達(dá)水平相關(guān)，血根堿可以下調(diào)FAK及磷酸化FAK的表達(dá)。 3.黑素瘤451LU細(xì)胞在三維培養(yǎng)模式下生長形態(tài)發(fā)生改變，三維培養(yǎng)的451LU細(xì)胞增殖能力較二維顯著提高，三維培養(yǎng)的451LU細(xì)胞對(duì)藥物敏感程度下降，三維培養(yǎng)條件下MMP2、ICAM1、p-gp、BRAF-V600E的基因表達(dá)水平升高。
【關(guān)鍵詞】：血根堿 藥物-藥物相互作用 侵襲 轉(zhuǎn)移 三維培養(yǎng)
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.5
【目錄】：

• 摘要10-14
• Abstract14-19
• 第一部分 血根堿對(duì)人肝細(xì)胞色素 P450 酶的抑制研究19-37
• (一) 前言19-21
• (二) 材料和方法21-23
• 1.試劑21
• 2.實(shí)驗(yàn)儀器21
• 3. HLMs 的孵育體系21-22
• 4. 血根堿對(duì)各個(gè)亞型 CYP 酶的可逆抑制22
• 5. 血根堿對(duì)各個(gè)亞型 CYP 酶基于時(shí)間依賴的抑制22-23
• 6. 血漿游離分?jǐn)?shù)的測定23
• 7. 基于體外數(shù)據(jù)預(yù)測體內(nèi)抑制程度23
• (三) 結(jié)果23-26
• 1. 血根堿對(duì)各個(gè)亞型 CYP 酶的可逆抑制制23-24
• 2. 血根堿對(duì)各個(gè)亞型 CYP 酶基于時(shí)間依賴的抑制24-25
• 3. 體內(nèi)DDI預(yù)測25-26
• (四) 討論26-31
• (五）結(jié)論31-32
• (六）參考文獻(xiàn)32-37
• 第二部分 血根堿對(duì)人惡性黑素瘤 451LU 細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力的影響37-64
• （一）前言37-38
• （二）材料和方法38-45
• 1. 材料38-39
• 1.1 主要試劑38
• 1.2 主要儀器設(shè)備38-39
• 1.3 細(xì)胞系39
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法39-45
• 2.1 451LU、WM35、ECV304 細(xì)胞復(fù)蘇39
• 2.2 451LU、WM35、ECV304 細(xì)胞傳代39-40
• 2.3 細(xì)胞活力測定40
• 2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測血根堿對(duì)451LU細(xì)胞活力的影響40-41
• 2.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)41
• 2.6 基質(zhì)-細(xì)胞粘附實(shí)驗(yàn)41
• 2.7 Transwell 腫瘤侵襲實(shí)驗(yàn)41
• 2.8 血根堿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響41-42
• 2.9 相關(guān)基因 mRNA 的表達(dá)42-43
• 2.9.1 細(xì)胞總RNA的提取42
• 2.9.2 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)體外擴(kuò)增 DNA42
• 2.9.3 realtime PCR 檢測相關(guān)基因的表達(dá)42-43
• 2.10 免疫細(xì)胞化學(xué)43
• 2.11 Western blot 檢測 MMP、ICAM-1、FAK、p-FAK 蛋白水平43-45
• 2.11.1 蛋白樣品的制備43-44
• 2.11.2 蛋白樣品的定量44
• 2.11.3 SDS-PAGE 電泳44
• 2.11.4 轉(zhuǎn)膜44-45
• 2.11.5 抗體孵育45
• 2.11.6 蛋白質(zhì)的化學(xué)發(fā)光檢測45
• 2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析45
• （三）結(jié)果45-53
• 1.SRB法檢測血根堿對(duì)451LU細(xì)胞細(xì)胞活力的影響45-46
• 2.流式細(xì)胞術(shù)檢測血根堿對(duì)451LU細(xì)胞活力的影響46-47
• 3.血根堿對(duì)451LU細(xì)胞粘附能力的影響47-48
• 4.血根堿對(duì)451LU細(xì)胞遷移能力的影響48-49
• 5.血根堿對(duì)451LU細(xì)胞侵襲能力的影響49-50
• 6.血根堿對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力的影響50-51
• 7.WM35及451LU細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)差異51
• 8.血根堿對(duì) 451LU 細(xì)胞 MMP2、ICAM-1mRNA 及蛋白表達(dá)的影響51-52
• 9.血根堿對(duì) 451LU 細(xì)胞 FAK、p-FAK 蛋白表達(dá)的影響52-53
• （四）討論53-57
• （五）總結(jié)57-58
• （六）參考文獻(xiàn)58-64
• 第三部分 451LU 細(xì)胞三維培養(yǎng)模型的構(gòu)建及評(píng)價(jià)64-83
• （一）前言64
• （二）材料和方法64-69
• 1. 主要試劑及儀器64-65
• 1.1 主要試劑64
• 1.2 主要儀器設(shè)備64-65
• 1.3 細(xì)胞系65
• 2. 實(shí)驗(yàn)方法65-69
• 2.1 451LU 細(xì)胞復(fù)蘇65
• 2.2 451LU 細(xì)胞傳代65-66
• 2.3 鼠尾膠原的制備66
• 2.4 451LU 細(xì)胞三維模型的構(gòu)建66
• 2.5 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察66
• 2.6 激光共聚焦顯微鏡觀察66
• 2.7 生長曲線測定66-68
• 2.7.1 總 DNA 的提取66-67
• 2.7.2 DNA 定量67-68
• 2.8 總 RNA 的抽提68
• 2.9 PCR 技術(shù)體外擴(kuò)增 DNA68
• 2.10 相關(guān)基因 mRNA 的檢測68-69
• 2.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析69
• （三）結(jié)果69-74
• 1.二維與三維培養(yǎng)條件，451LU 細(xì)胞形態(tài)的變化69-70
• 2.二維與三維培養(yǎng)條件，451LU 細(xì)胞生長曲線的變化70
• 3.共聚焦顯微鏡觀察三維培養(yǎng)條件下 451LU 細(xì)胞細(xì)胞活力的變化70-71
• 4.阿霉素、長春堿、紫杉醇、血根堿對(duì)二維與三維培養(yǎng)條件下 451LU細(xì)胞細(xì)胞活力的影響71-73
• 5.二維與三維培養(yǎng)條件下， 451LU 細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)差異73-74
• （四）討論74-78
• （五）總結(jié)78-79
• （六）參考文獻(xiàn)79-83
• 綜述83-100
• 參考文獻(xiàn)90-100
• 發(fā)表文章、參與課題及科研獲獎(jiǎng)100-102
• 致謝102-103

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：760733