本文關鍵詞：調節(jié)性T細胞在銀屑病中的作用及機制研究

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【摘要】：目的明確調節(jié)性T細胞(T regulatory cells,Treg)在銀屑病發(fā)病中作用,探討Treg細胞參與銀屑病發(fā)病的關鍵分子機制。方法收集81例銀屑病患者及46例健康人外周血,流式細胞術(Flow cytometry,FCM)檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細胞占CD4+T細胞的比例;分選銀屑病患者及健康人CD4+CD25+CD127-Treg細胞和CD4+CD25-CD127+效應T細胞(T effective cell,Teff),利用淋巴細胞共培養(yǎng)模型研究Treg細胞增殖能力及免疫抑制功能;通過表達譜芯片篩選銀屑病患者Treg細胞差異基因表達,GO聚類分析關鍵的信號通路,q PCR和FCM驗證表達的差異基因;根據篩選分析結果,q PCR、免疫熒光和Western blot檢測銀屑病外周血及皮損Treg細胞功能缺陷關鍵分子Foxo1和AKT的m RNA、蛋白磷酸化水平及細胞內表達定位;利用健康人及銀屑病患者血清刺激Treg細胞,免疫熒光和Western blot檢測AKT和Foxo1的蛋白磷酸化水平及表達定位;CHIP檢測Foxo1和T-bet的啟動子區(qū)結合情況;Foxo1 sh RNA轉染健康人Treg細胞,淋巴細胞共培養(yǎng)檢測Treg細胞的增殖能力及免疫抑制功能,FCM檢測Treg細胞中T-bet和IFN-γ表達水平;利用T細胞回輸聯合咪喹莫特(Imiquimod,IMQ)誘導Rag2-/-小鼠銀屑病樣模型,研究Treg細胞在銀屑病發(fā)病中的作用;分選Foxo1敲除小鼠和WT小鼠的Treg細胞,利用T細胞回輸聯合IMQ誘導Rag2-/-小鼠銀屑病模型,明確Foxo1在Treg細胞參與銀屑病發(fā)病中的作用。結果銀屑病患者外周中Treg細胞占CD4+T細胞比例與健康人相比無明顯差異(P=0.1365);且與銀屑病嚴重程度呈正相關性(R2=0.2580,P0.001);銀屑病患者Treg細胞的增殖能力明顯降低,其抑制Teff細胞活化能力也明顯低于健康人Treg細胞;表達譜芯片結果顯示銀屑病患者外周血中Treg細胞表達大量以IFN-γ為主的促炎因子,將銀屑病患者Treg細胞的基因表達譜與Foxo1-/-Treg細胞的表達譜比對,發(fā)現Foxo1-/-Treg細胞中60%的基因表達變化趨勢與銀屑病患者Treg細胞的基因表達譜一致;q PCR檢測結果發(fā)現銀屑病患者Treg細胞中Foxo1的m RNA水平與健康人相比無明顯差異,介導Foxo1磷酸化的AKT的m RNA水平明顯高于健康人,Western blot結果顯示銀屑病患者Treg細胞中AKT磷酸化水平升高,同時Foxo1的Thr24位點磷酸化水平明顯升高,Foxo1總量表達明顯降低;免疫熒光結果顯示,健康人Treg細胞中Foxo1主要表達在胞核內,而銀屑病患者Treg細胞中Foxo1大量向胞漿遷移;血清刺激實驗中發(fā)現,與健康人血清相比,銀屑病患者血清能夠明顯抑制Treg細胞的免疫抑制功能,增加AKT的磷酸化水平,促進Foxo1向胞漿遷移,使其失去轉錄活性;CHIP的結果發(fā)現Treg細胞中Foxo1可以和T-bet的啟動子區(qū)相結合;利用Foxo1sh RNA抑制健康人Treg細胞中的Foxo1表達,能夠明顯抑制Treg細胞增殖能力及免疫抑制功能,促進Treg細胞表達T-bet和IFN-γ;銀屑病小鼠模型顯示,局部回輸Treg細胞能夠明顯緩解小鼠銀屑病樣皮損的嚴重程度,而局部回輸Foxo1-/-Treg細胞則不能有效緩解實驗小鼠銀屑病樣表型。結論我們的研究明確了銀屑病存在Treg細胞功能缺陷,并證實其在銀屑病發(fā)病中發(fā)揮重要作用;發(fā)現銀屑病患者異常的免疫微環(huán)境造成Treg細胞中AKT介導的Foxo1磷酸化水平升高,促進Foxo1向細胞漿遷移,使其轉錄活性降低,導致Treg細胞功能缺陷。本研究首次證實Foxo1磷酸化是Treg細胞功能異常及影響銀屑病發(fā)病的關鍵分子機制。
【關鍵詞】：銀屑病 調節(jié)性T細胞 Foxo1
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R758.63
【目錄】：

• 縮略語表6-9
• 中文摘要9-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-16
• 文獻回顧16-31
• 1. 銀屑病概況16
• 2. T細胞活化介導銀屑病發(fā)病16-18
• 3. 調節(jié)性T細胞18-24
• 4. Foxo1對調節(jié)性T細胞發(fā)育及功能的調控作用24-28
• 5. 調節(jié)性T細胞參與銀屑病發(fā)病28-31
• 1 材料31-40
• 1.1 主要試劑31-33
• 1.2 主要耗材33-34
• 1.3 主要儀器34-36
• 1.4 主要試劑配制方法36-40
• 2 方法40-53
• 2.1 臨床樣本40
• 2.2 實驗動物來源、鑒定及誘導基因敲除方法40-41
• 2.3 外周血單個核細胞（PBMC）分離41
• 2.4 細胞培養(yǎng)和復蘇41-42
• 2.5 小鼠脾臟單細胞懸液制備42
• 2.6 銀屑病小鼠模型建立42
• 2.7 流式細胞分析42-43
• 2.8 流式細胞分選43
• 2.9 調節(jié)性T細胞抑制功能43-44
• 2.10 調節(jié)性T細胞增殖功能44
• 2.11 慢病毒轉染調節(jié)性T細胞模型44-45
• 2.12 血清刺激調節(jié)性T細胞模型45
• 2.13 RNA提取和cDNA反轉錄45-46
• 2.14 擴增PCR及瓊脂糖凝膠電泳46
• 2.15 實時熒光定量PCR46-48
• 2.16 蛋白提取及Western Blot48-49
• 2.17 石蠟切片和HE切片染色49-50
• 2.18 冰凍切片制備50
• 2.19 免疫熒光50-51
• 2.20 染色質共沉淀（Chromatin Immunoprecipitation，，CHIP）51-52
• 2.21 統(tǒng)計方法52-53
• 3 結果53-70
• 3.1 銀屑病患者調節(jié)性T細胞數量比例無明顯異常53-54
• 3.2 銀屑病患者調節(jié)性T細胞增殖能力低下54-55
• 3.3 銀屑病患者調節(jié)性T細胞免疫抑制功能減弱55-56
• 3.4 銀屑病患者調節(jié)性T細胞異常表達Th1細胞相關細胞因子56-59
• 3.5 銀屑病患者調節(jié)性T細胞AKT - Foxo1通路過度激活59-62
• 3.6 銀屑病患者血清促進調節(jié)性T細胞AKT - Foxo1通路激活62-63
• 3.7 Foxo1通過T-bet - IFN-γ 通路影響調節(jié)性T細胞功能63-65
• 3.8 調節(jié)性T細胞回輸能夠緩解IMQ誘導小鼠銀屑病樣表型65-68
• 3.9 Foxo1缺陷的Treg細胞不能有效緩解小鼠銀屑病樣表型68-70
• 4 討論70-78
• 小結78-79
• 參考文獻79-90
• 附錄90-92
• 個人簡歷和研究成果92-94
• 致謝94

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