本文關鍵詞：Diallyl Disulfide對化學誘導皮膚癌的預防作用及其作用機制研究

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【摘要】：[研究背景與目的]癌癥患者數(shù)量與日俱增,通過手術切除、放化療、甚至分子靶向抑制劑等單純的治療都無法完全根治癌癥,且醫(yī)療花費巨大。癌癥等重大疾病的的預防一直是研究的重點。選擇低毒、經(jīng)濟且可長期應用的天然化合物預防癌癥的策略正逐步受到人們的重視。黑蒜是一種新型的大蒜加工食品,具有抗菌、抗腫瘤、抗炎等許多生物學活性。黑蒜中的Diallyl Disulfide (DADS)具有抑制腫瘤細胞增殖、促進腫瘤細胞凋亡及抑制腫瘤細胞轉移的潛能。本研究在于考察DADS對于化學致癌物誘導的小鼠皮膚癌體內和體外模型的預防作用,并闡明其確切的作用機制。[研究內容與結果]本研究首先利用經(jīng)典的DMBA/TPA兩階段致癌模型及TPA誘導的JB6 P+細胞克隆形成實驗分別在體內外考察DADS的癌癥預防作用。結果表明預先給予DADS在體內可以濃度依賴性地降低皮膚乳突狀淋瘤的發(fā)生率、平均荷瘤數(shù)目、腫瘤的大小以及在體外同樣可以濃度依賴性地減少TPA誘導的克隆形成數(shù)目�？紤]到DADS具有較強的抗氧化活性,通過檢測小鼠背部皮膚中活性氧簇(Reactive Oxygen Species, ROS)的水平,發(fā)現(xiàn)預先給予DADS可以清除TPA誘導的高水平ROS含量,這主要與抗氧化酶活力的升高有關。采用Real-time PCR檢測,發(fā)現(xiàn)DADS在體內外模型中均可以濃度依賴性地提升抗氧化酶的mRNA水平。進一步通過免疫組化和WesternBlot研究發(fā)現(xiàn)DADS可以在體內外濃度依賴性地促進小鼠皮膚細胞中的Nrf2入核。以上結果初步表明DADS的癌癥預防作用與誘導Nrf2入核相關。選用Nrf2-/-小鼠進行反向驗證,結果表明DADS無法預防DMBA/TPA誘導的Nrf2-/-小鼠背部皮膚乳突狀淋瘤的發(fā)生與生長以及無法減少DMBA/TPA誘導的小鼠背部皮膚增厚。由此證明了DADS是通過誘導Nrf2入核促進抗氧化酶表達增多發(fā)揮癌癥預防作用。利用細胞在體外探究DADS促進Nrf2入核的具體機制,通過WesterBlot和免疫熒光實驗初步發(fā)現(xiàn)DADS可以時間依賴性地上調Nrf2的核表達。其中,DADS作用4-8h時能顯著增加Nrf2的核內表達。另外,通過給予p-Akt抑制劑MK2206反向驗證,進一步排除了DADS是通過激活MAPKs和Akt信號通路后引起Nrf2入核的級聯(lián)反應。進一步研究發(fā)現(xiàn),DADS能夠時間依賴地誘導Nrf2總蛋白表達水平升高,但不影響Nrf2的mRNA水平。選用蛋白酶抑制劑MG132與DADS合用,結果表明DADS與MG132協(xié)同抑制Nrf2降解。由此可知DADS是通過抑制Nrf2的降解,從而引起了Nrf2的胞內蓄積及后續(xù)的入核。為了探究DADS抑制Nrf2降解的機制,我們首先排除了DADS對Nrf2胞內抑制因子Keap1的影響。而DADS能夠時間依賴地增加Nrf2的另一個結合蛋白p21的表達水平。而p21可以與Keap1競爭性結合Nrf2,減少其降解。通過免疫共沉淀檢測發(fā)現(xiàn)DADS不僅能促進p21的表達,而且能夠促進p21與Nrf2的結合,進而減少了Nrf2的降解。此外,我們選用HEK293T細胞轉染p21 siRNA反向驗證了p21在DADS調節(jié)Nrf2蛋白水平過程中的重要作用。[結論與意義]基于以上結果,我們發(fā)現(xiàn)DADS成分可以預防化學致癌物誘導的小鼠背部皮膚乳突狀淋瘤的發(fā)生和生長。給予DADS能夠促進p21與Nrf2結合增多,進而減少了Nrf2的降解,增加了Nrf2的核表達并啟動下游轉錄,促進抗氧化酶的表達上調,從而減少了ROS對機體的損傷,最終發(fā)揮了癌癥預防作用。該課題闡明了DADS具有很好的癌癥預防潛能并明確了DADS發(fā)揮癌癥預防作用的機制,為DADS進入臨床研究及日常生活中的應用提供了一個有力的證據(jù)。
【關鍵詞】：Diallyl Disulfide 腫瘤 皮膚 Nrf2 p21
【學位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 第一部分 前言11-13
• 1. 針對晚期癌癥患者的研究并不能解決嚴峻的問題11
• 2. 利用天然化合物預防癌癥是抗癌研究的重要策略11
• 3. DMBA/TPA兩階段致癌模型是評價藥物癌化學預防作用的經(jīng)典模型11-12
• 4. 黑蒜提取物中的DADS具有癌癥預防的潛能12
• 5. 課題假說的提出12
• 6. 課題意義12-13
• 第二部分 DADS在體內外對化學誘導的小鼠皮膚癌模型的預防作用13-22
• 1. DADS對DMBA/TPA誘導的小鼠皮膚癌的預防作用13-17
• 2. DADS對TPA誘導JB6 P+細胞克隆形成的預防作用17-21
• 3. 討論21-22
• 第三部分 DADS在體內外對抗氧化系統(tǒng)的影響22-33
• 1. DADS抑制DMB-TPA誘導ROS的表達22-24
• 2. DADS在體內外促進抗氧化酶的活性24-28
• 3. DADS在體內外促進抗氧化酶的mRNA水平28-32
• 4. 討論32-33
• 第四部分 DADS促進Nrf2入核發(fā)揮皮膚癌預防作用研究33-43
• 1. DADS促進各抗氧化酶上游Nrf2入核及轉錄活性33-39
• 2. DADS無法對DMBA/TPA誘導的Nrf2~(-/-)小鼠皮膚癌發(fā)揮預防作用39-42
• 3. 討論42-43
• 第五部分 DADS在體外促進Nrf2入核的機制研究43-53
• 1. DADS時間依賴地促進JB6 P+細胞中Nrf2的核表達增多43-46
• 2. DADS對JB6 P+細胞中Nrf2的上游信號通路的影響46-48
• 3. DADS促進JB6 P+細胞中Nrf2的總蛋白升高的影響及其機制48-52
• 4. 討論52-53
• 總結與展望53-55
• 1. 總結53-54
• 2. 論文的創(chuàng)新點54
• 3. 研究的不足和展望54-55
• 綜述55-59
• 參考文獻59-67
• 附錄67-72
• 正文涉及常規(guī)試劑配置表67-69
• 正文實驗涉及抗體表69-70
• 正文實驗涉及引物表70-71
• 正文涉及縮略詞表71-72
• 攻讀碩士學位期間取得的學術成果72-73
• 發(fā)表文章72
• 獲得獎項72-73
• 致謝73

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