[RASSF1A基因在黑色素瘤細胞和組織中表達下調(diào)]RASSFIA是定位于腫瘤高頻雜合性丟失區(qū)域3p21.3位點的抑瘤基因,編碼一個微管相關(guān)蛋白。該基因在多種實體瘤組織中因啟動子高甲基化而表達沉默,是迄今為止在腫瘤組織中甲基化程度最高的基因之一。前期多項研究指出,除了在上皮性腫瘤中發(fā)生甲基化之外,RASSF1A基因在惡性黑色素瘤細胞中也存在高頻甲基化,提示該基因在黑色素瘤的發(fā)生過程中也可能存在表達異常。在本研究中,我們首次采用免疫組織化學及western blot的方法研究了RASSFIA基因在正常皮膚組織、皮膚色素痣以及惡性黑色素瘤組織和細胞系中的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn),RASSF1A蛋白在正常皮膚色素細胞和色素痣細胞中高表達,而在惡性黑色素瘤組織中表達下調(diào)甚至缺失,并與腫瘤的轉(zhuǎn)移呈負相關(guān)。RASSFIA蛋白在非轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞系中有微弱表達,而在轉(zhuǎn)移性黑色素瘤細胞系中表達缺失。該結(jié)果證實了RASSFIA在黑色素瘤組織和細胞中表達下調(diào),強烈提示RASSFIA參與了黑色素瘤的發(fā)生與演進過程。[RASSFIA基因具有抑制黑色素瘤細胞生長、增殖的作用]以往關(guān)于RASSFIA基因功能的研究絕大部分... 

【文章來源】：中南大學湖南省211工程院校985工程院校教育部直屬院校

【文章頁數(shù)】：105 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮寫詞簡表
目錄
技術(shù)路線
第一章 前言
第二章 材料與方法
    1 材料
        1.1 細胞
        1.2 菌株和質(zhì)粒載體
        1.3 試劑
        1.4 主要儀器
    2 方法
        2.1 免疫組化
        2.2 pIRES-RASSF1A載體的構(gòu)建
        2.3 細胞RNA制備
        2.4 培養(yǎng)細胞總蛋白制備
        2.5 線粒體和胞漿蛋白的抽提
        2.6 SDS-PAGE凝膠電泳
        2.7 基因瞬時轉(zhuǎn)染
        2.8 siRNA瞬時轉(zhuǎn)染
        2.9 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染A375細胞系的建立
        2.10 免疫熒光實驗
        2.11 細胞生長曲線測定
        2.12 平板集落形成實驗
        2.13 裸鼠成瘤實驗
        2.14 FCM檢測細胞周期和細胞凋亡
        2.15 Hoechst33258染色檢測細胞凋亡
        2.16 人類全基因組表達譜芯片雜交(由博奧生物有限公司完成)
        2.17 差異表達基因的raltime RT-PCR驗證
第三章 結(jié)果
    第一部分 RASSF1A基因在黑色素瘤細胞和組織中的表達
        3.1.1 RASSF1A基因在黑色素瘤組織中的表達
        3.1.2 RASSF1A表達與惡黑臨床相關(guān)分析
        3.1.3 RASSF1A蛋白在黑色素瘤細胞系中的表達
    第二部分 RASSF1A基因過表達對A375細胞的影響
        3.2.1 RASSF1A真核表達載體的構(gòu)建
        3.2.2 RASSF1A穩(wěn)定轉(zhuǎn)染黑色素瘤細胞系的建立
        3.2.3 RASSF1A對A375細胞生長與增殖的影響
        3.2.4 RASSF1A對A375細胞集落形成能力的影響
        3.2.5 RASSF1A對A375細胞形態(tài)影響
        3.2.6 RASSF1A抑制A375細胞裸鼠移植瘤的形成
        3.2.7 RASSF1A促進A375細胞凋亡
        3.2.8 RASSF1A對A375細胞周期的影響
        3.2.9 RASSF1A對細胞周期調(diào)控分子表達的影響
        3.2.10 RASSF1A通過降低cyclin D1蛋白穩(wěn)定性抑制其表達
    第三部分 RASSF1A對黑色素瘤細胞基因表達譜的影響
        3.3.1 RASSF1A基因?qū)375細胞基因表達譜的影響
        3.3.2 差異表達基因的生物信息學分析
        3.3.3 差恂表達基因KEGG和BIOCARTA數(shù)據(jù)庫pathway分析
        3.3.4 差異表達基因的進一步驗證
    第四部分 RASSF1A調(diào)控惡黑細胞凋亡和細胞周期的分子機制
        3.4.1 RASSF1A上調(diào)ASK1表達激活p38 MAPK信號途徑
        3.4.2 RASSF1A對cytochrome c亞細胞分布的影響
        3.4.3 RASSF1A誘導惡黑細胞凋亡的作用部分依賴于ASK1
        3.4.4 RASSF1A抑制了AKT/mTOR信號通路的活化
        3.4.5 AKT可以逆轉(zhuǎn)RASSF1A對信號通路的調(diào)節(jié)作用
第四章 討論
    4.1 RASSF1A蛋白在惡黑組織和細胞系中表達下調(diào)
    4.2 RASSF1A具有抑制惡黑A375細胞生長與增殖的作用
    4.3 RASSF1A下調(diào)cyclin D1和p-Rb表達,引起A375細胞周期G1-S期阻滯
    4.4 RASSF1A促進A375細胞凋亡
    4.5 RASSF1A調(diào)控的A375差異基因表達譜的構(gòu)建
    4.6 RASSF1A通過上調(diào)ASK1促進細胞凋亡的分子機制
    4.7 RASSF1A抑制了惡黑細胞AKT/mTOR信號通路
    4.8 Summary:RASSF1A抑制了惡黑細胞生物學表型的分子機制
結(jié)論
參考文獻
綜述
致謝
個人簡歷


【參考文獻】：
期刊論文
[1]惡性黑色素瘤的研究進展[J]. 烏新春,段晰所.  承德醫(yī)學院學報. 2008(03)
[2]人類表觀基因組計劃[J]. 黃慶,郭穎,府偉靈.  生命的化學. 2004(02)
[3]北京城區(qū)1993-1997年惡性腫瘤發(fā)病率分析[J]. 祝偉星,王啟俊,李玲,邢秀梅.  腫瘤防治雜志. 2003(08)



本文編號：3627729