本文關鍵詞：靶向Notch1的siRNA抑制小鼠惡性黑色素瘤細胞增殖的體內(nèi)外研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：背景： 惡性黑色素瘤(Malignant Melanoma, MM),是起源于神經(jīng)脊黑色素細胞的惡性腫瘤。近幾十年來,惡性黑色素瘤在全球的發(fā)病率迅猛升高,成為所有惡性腫瘤中發(fā)病率增長最快的腫瘤,年增長率幾乎達到3-5%。其中白色人種發(fā)病率明顯高于其他人種,澳大利亞昆士蘭地區(qū)和美國的南亞利桑那州為惡性黑色素瘤的高發(fā)地區(qū),我國和日本等亞洲國家的黑色素瘤發(fā)病率與歐美國家相比相對較低,但近年來其發(fā)病率呈迅猛上升趨勢。惡性黑色素瘤是世界上惡性程度較高的腫瘤之一,該病起病隱匿,易發(fā)生轉移,當前已成為發(fā)達國家皮膚癌死亡率最高的腫瘤。它的預后因素與年齡、性別、部位、腫瘤的浸潤深度、淋巴結轉移情況、是否潰瘍及手術方式等相關。對于早期的局限性病變,外科手術切除是黑色素瘤的最佳治療原則,然而術后發(fā)生轉移的幾率大。對于晚期轉移性惡性黑色素瘤患者,絕大多數(shù)需接受全身性系統(tǒng)治療,但是黑色素瘤細胞對傳統(tǒng)的放、化療均不敏感,所以尋求治療惡性黑色素瘤的治療靶點迫在眉睫。 Notch信號通路不僅對正常細胞的分化起作用,而且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展也密切相連,影響腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡等。在哺乳動物中,Notch是由4個受體(Notchl-4)及5個配體(Delta-likel,3-4, and Jaggedl-2)組成。這條通路激活是通過Notch受體與相鄰細胞表面的配體結合,引起Notch受體細胞外結構的改變,導致γ-分泌酶復合體切割并釋放Notch受體胞內(nèi)區(qū)NICD(Notchintracellular domain)進入細胞核,NICD通過其RAM(RBP Jk associated molecular)結構域與CSL(CBF-1/suppressor of hairless/Lag-1)蛋白結合導致共抑制復合物解離,并募集共活化分子MAML1(mastermind-like1)組成共三聚體,從而啟動下游基因的轉錄。在Notch的4個受體當中,Notch1是在腫瘤組織中最常被檢測到的家族成員,對腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及演進的過程起到了關鍵性作用。值得注意的是,Notch信號通路在腫瘤形成過程中既可以充當促癌基因角色又可以充當抑癌基因角色,主要取決于不同腫瘤以及其不同的發(fā)展階段。近年來對惡性黑色素瘤的研究發(fā)現(xiàn),Notch1呈高表達狀態(tài)并主要起著促癌作用,Notch1蛋白的高表達和天然活化阻止黑色素細胞正常分化,從而導致黑色素腫瘤的發(fā)生,間接參與了黑色素細胞的早期惡變。 siRNA干擾技術是近年來基因表達調(diào)控的研究熱點之一,它是由小分子干擾RNA引發(fā)誘導的轉錄后的基因沉默過程。與傳統(tǒng)的腫瘤抑制治療技術相比,siRNA不僅簡單有效,而且能特異地下調(diào)細胞中基因的表達。目前,siRNA靶向抑制Notch1基因進而抑制腫瘤細胞生長與增殖的相關現(xiàn)象已在膠質(zhì)瘤、腎癌、前列腺癌、胰腺癌、急性T淋巴細胞白血病等腫瘤疾病的研究中得到了證實。 但在惡性黑色素瘤中,靶向Notch1基因的siRNA是否也可以下調(diào)Notch及其下游信號傳導通路來發(fā)揮其生物學作用,還需要我們進一步證實。因此,本研究擬用RNA干擾技術來探討Notch1在惡性黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。以小鼠惡性黑色素瘤B16F1細胞為研究對象,應用siRNA技術下調(diào)Notch1的表達,體外觀察其對黑色素瘤細胞增殖的影響；同時,擬將轉染后細胞注射至同基因來源的C57BL/6小鼠皮下,觀察腫瘤的生長速度及Notch1、增殖活躍性指標細胞核相關抗原Ki-67、增殖細胞核抗原PCNA的表達變化,從而明確Notch1在體內(nèi)對黑色素瘤增殖的影響。 目的： 1.探討通過siRNA技術沉默Notch1進而抑制小鼠惡性黑色素瘤生長與細胞增殖的可行性。 2.探討Notch1是否能作為治療惡性黑色素瘤的靶點,進而為尋求治療惡性黑色瘤的新方法提供理論依據(jù)。 材料與方法： 1.主要的實驗材料 1.1細胞及實驗動物來源 小鼠惡性黑色素瘤細胞株B16F1由美國芝加哥大學孟玉茹教授贈與；C57BL/6雌性小鼠,6-8周齡,體質(zhì)量18-22g,購自南方醫(yī)科大學實驗動物中心,于南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院實驗動物研究中心SPF級環(huán)境中飼養(yǎng)。 1.2實驗試劑 胎牛血清、高糖DLipofectamineTM2000、Notchl siRNA Oligo及陰性對照、Trizol、PrimeScript(?) RT reagent試劑盒、SYBR(?) Premix Ex TaqTM試劑盒、Notchl引物、山羊抗小鼠的Notchl多克隆抗體、RIPA裂解液、SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、PVDF膜、MTT試劑盒、DMSO、結晶紫染料、兔抗小鼠的Ki-67單克隆抗體、兔抗小鼠的PCNA多克隆抗體、辣根過氧化酶(HRP)標記山羊二抗試劑盒、HRP標記兔二抗試劑盒、DAB顯色劑、AEC顯色劑、蘇木素、伊紅、無水乙醇、95%酒精、1%鹽酸酒精等。 1.3實驗儀器 二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱、超凈工作臺、恒溫循環(huán)水浴鍋、光學顯微鏡、熒光顯微鏡、高速冷凍離心機、臺式離心機、電泳系統(tǒng)、酶標儀、PCR儀、熒光定量PCR反應儀、分光光度計、石蠟切片機、石蠟包埋機、-80℃冰箱、通風柜、微波爐、電子秤、游標卡尺、眼科剪、眼科鑷、lml注射器、培養(yǎng)皿、吸管、微量移液器、試管、EP管、凍存管、載玻片、蓋玻片等。 2.細胞培養(yǎng) B16F1細胞株用含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng),置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),倒置顯微鏡下觀察細胞生長情況,每2-3天行傳代培養(yǎng)。 3.實驗流程 3.1靶向Notchl基因的siRNA轉染小鼠惡性黑色素瘤B16F1細胞株 利用siDESIEN網(wǎng)站設計靶向Notchl基因的siRNA,委托由上海吉瑪生物公司合成。前期從預先設計的6對序列中選出1對作為目的siRNA,采用Invitrogen公司的lipofectamineTM2000介導的脂質(zhì)體轉染技術轉染細胞。轉染了靶向Notch1基因siRNA的B16F1細胞用siNotch1表示、轉染空載體siRNA陰性對照(negative control)的B16F1細胞用siNC表示、只加轉染試劑lipofectamineTM2000對照的未處理B16F1細胞用mock表示。轉染后采用RT-PCR以及Western blot驗證沉默效率。 3.2siNotch1對B16F1細胞體外生長特性的比較分析 經(jīng)上述siRNA技術瞬時轉染的小鼠惡性黑色素瘤B16F1細胞株,行MTT比色法檢測細胞增殖能力以及細胞克隆試驗觀察三組細胞克隆形成能力,克隆形成率的計算方式為形成克隆的數(shù)目／接種細胞的數(shù)目×100%,體外初步評價Notch1對惡性黑色素瘤細胞生物學功能的影響。 3.3siNotch1對B16F1細胞體內(nèi)生長特性的比較分析 分別用轉染后的三組細胞建立C57BL/6小鼠惡性黑色素瘤模型,動物皮下成瘤后每3-4天進行一次相應siRNA的瘤內(nèi)注射,以保證穩(wěn)定的轉染效果,接種后的第31天斷頸處死小鼠,取腫瘤標本比較各組腫瘤體積并行HE染色觀察組織病理改變以及免疫組化檢測腫瘤組織Notch1蛋白、細胞核相關抗原Ki-67及增殖細胞核抗原PCNA的表達情況。免疫組化染色結果采用雙盲法判定,每張切片隨機選擇5個高倍視野(x400),每個視野計數(shù)100個細胞,計算陽性細胞占腫瘤細胞的占百分比。 4.數(shù)據(jù)分析 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件行統(tǒng)計學處理。實驗數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(x±s)表示,采用單因素方差分析RT-PCR、Western blot、細胞克隆及免疫組化實驗的統(tǒng)計學差異,采用析因方差分析MTT細胞增殖的檢測以及腫瘤體積觀察。所有檢驗均為雙側檢驗,當P0.05時差異具有統(tǒng)計學意義。 結果： 1.siNotchl成功轉染小鼠惡性黑色素瘤B16F1細胞株結果表明,通過RT-PCR和Western blot檢測,siNotchl轉染B16F1細胞后的Notchl表達水平較空載體siNC組和未處理mock組顯著降低(P0.05),而siNC和mock組細胞間的Notchl表達水平無差異(P0.05)。 2. siNotchl體外抑制小鼠惡性黑色素瘤細胞的增殖以及克隆形成MTT實驗結果表明,從轉染后的第2天開始,siNotchl沉默組的增殖速度顯著慢于siNC空載體組和未處理mock組(P0.05)。同樣,細胞克隆形成實驗結果顯示siNotchl組、siNC組以及mock組細胞的克隆形成率分別為(0.157±0.021)%、(0.760±0.030)%、(0.787±0.031)%, siNotch1沉默組顯著低于siNC和mock組(P0.05),而空載體siNC組和未處理mock組細胞間克隆形成率無差異(P0.05)。 3. siNotchl體內(nèi)抑制小鼠惡性黑色素瘤的成瘤能力結果發(fā)現(xiàn),第31天處死小鼠,測量腫瘤體積,三組的腫瘤平均體積分別為1307.947±161.914mm3,2970.683±140.945mm3和3078.987±252.257mm3,siNotchl組的腫瘤體積顯著小于siNC和mock組,有統(tǒng)計學差異(P0.05),而siNC和mock組之間的瘤體積則無顯著差異(P0.05)。HE染色發(fā)現(xiàn)siNotchl沉默組腫瘤組織鏡下見多處大片壞死灶,腫瘤細胞異型性不明顯,siNC空載體組及mock未處理組腫瘤細胞異型性明顯,組織中含豐富的新生血管,壞死灶較少。免疫組化結果顯示siNotchl沉默組、siNC空載體組及mock未處理組Notchl蛋白的陽性細胞百率分別為(41.44±6.84)%、(87.20±4.53)%、(90.36±5.25)%,siNotchl組明顯低于另兩組(P0.05)。同樣,增殖指標Ki-67和PCNA的表達在siNotchl組的表達也顯著低于其他兩對照組,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。 結論： 1.在小鼠惡性黑色素瘤中,通過siRNA技術沉默Notchl是可行的,并且在體內(nèi)外抑制了小鼠惡性黑色素瘤B16F1細胞的增殖與腫瘤的生長。 2. Notchl基因在小鼠惡性黑色素瘤細胞的增殖中起至關重要的作用,可望成為治療惡性黑色素瘤的有效靶點,而siNotchl可能是治療惡性黑色素瘤的有效途徑。
【關鍵詞】：小鼠惡性黑色素瘤 Notch1 siRNA 動物模型
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-31
• 參考文獻24-31
• 第一部分 體外實驗探討Notch1沉默對黑色素瘤細胞株B16F1增殖功能的影響31-50
• 一、材料與方法31-40
• 二、結果40-46
• 三、討論46-48
• 參考文獻48-50
• 第二部分 體內(nèi)實驗探討Notch1沉默對黑色素瘤細胞株B16F1增殖功能的影響50-65
• 一、材料與方法50-57
• 二、結果57-61
• 三、討論61-63
• 參考文獻63-65
• 全文總結65-66
• 本研究的局限性與進一步研究的方向66-67
• 縮略語中英文對照67-70
• 成果70-71
• 致謝71-72

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本文編號：344181