目的在前期研究的基礎上進一步驗證miR-148a-3p通過促凋亡蛋白Bim對銀屑病發(fā)病機制中T細胞亞群分化的影響及相關免疫應答機制的調(diào)控。方法培養(yǎng)人T淋巴白血�。↗urkat）細胞;Bim siRNA、miR-148a-3p mimics、miR-148a-3p inhibitor,分別電轉(zhuǎn)CD4⁺T細胞,RT-qPCR檢測miR-148a-3p和Bim mRNA,Western blot檢測Bim蛋白;通過ELISA檢測培養(yǎng)上清中細胞因子含量。結果 Bim siRNA、miR-148a-3p mimics、miR-148a-3p inhibitor分別電轉(zhuǎn)CD4⁺T細胞（Jurkat細胞）,電轉(zhuǎn)效率可達84.5%。與空白組相比,過表達的miR-148a-3p可有效抑制靶基因Bim mRNA及其蛋白的表達,ELISA檢測培養(yǎng)上清中IFN-γ及IL-17均明顯升高,IL-4及IL-10均明顯降低（P均<0.05）;而抑制miR-148a-3p時Bim mRNA及其蛋白的表達升高,IFN-γ明顯減少（P均<0.05）,而IL-17表達... 

【文章來源】：中國皮膚性病學雜志. 2020,34(07)北大核心CSCD

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【部分圖文】：

Western blot檢測Bim

為進一步探索CD4+T細胞中miR-148a-3p對Bim的調(diào)控機制,本研究在Jurkat細胞中模擬miR-148a-3p的表達以進一步觀察其在銀屑病發(fā)病機制中可能的作用。Jurkat細胞屬于急性T細胞白血病細胞系的一種懸浮細胞,通常用于研究T細胞信號傳導以及易感病毒進入的各種趨化因子受體,其比原代細胞繁殖速度快,易培養(yǎng)。但由于T細胞轉(zhuǎn)染效率低下,本實驗綜合各方面條件對比之后選擇電轉(zhuǎn),前期預實驗通過Cy3-siRNA電轉(zhuǎn)Jurkat細胞效率檢測可達84.5%。本研究發(fā)現(xiàn),在正常CD4+T細胞中過表達miR-148a-3p時,Bim mRNA及蛋白的表達水平顯著低于對照組,且Th1細胞相關因子IFN-γ及Th17相關細胞因子IL-17均顯著升高,Th2細胞相關細胞因子IL-4及Treg相關細胞因子IL-10均明顯降低。在正常CD4+T細胞中沉默Bim的表達,IFN-γ及IL-17亦顯著升高。而在CD4+T細胞中抑制miR-148a-3p的表達時Bim mRNA及蛋白的表達水平明顯上調(diào),同時IFN-γ明顯降低,IL-4及IL-10均明顯升高。這說明在銀屑病患者中高表達的miR-148a-3p可導致Th1、Th17細胞異常活化,Th2細胞活化及Treg細胞免疫抑制功能減弱,抑制其表達可有效控制Th1過度活化并提高Treg細胞的免疫抑制功能,這進一步證實miR-148a-3p可能作為治療銀屑病的新靶點,為后續(xù)miR-148a-3p靶向干預尋常性銀屑病病情提供了實驗依據(jù)。

與mimic NC組相比,miR-148a-3p mimics組CD4+T細胞分泌的IFN-γ和IL-17顯著升高(t=-12.03,-10.7;P<0.05);與無關對照(scr-siRNA)組相比,Bim siRNA組CD4+T細胞分泌的IFN-γ和IL-17也顯著升高(t=-9.91,-7.92;P<0.05)。而與mimic NC組相比,miR-148a-3p mimics組IL-10及IL-4的表達水平顯著下降(t=13.76,16.07;P<0.05);與無關對照(scr-siRNA)組相比,Bim siRNA組與NC組相比,IL-10及IL-4的表達水平也顯著下降(t=17.15,10.02;P<0.05)。與inhibitor NC組相比,miR-148a-3p inhibitor組的IFN-γ表達顯著下降(t=10.77,P<0.01),IL-17表達水平下降但不具有統(tǒng)計學意義,IL-10及IL-4的表達水平顯著升高(t=-10.66,-30.19;P<0.01),見圖5。圖2 miR-148a-3p的變化對miR-148a-3p()、Bim mRNA()的表達水平影響


本文編號：3369819