本文關(guān)鍵詞：miR-196a2單核苷酸多態(tài)性與白癜風(fēng)易感性的關(guān)聯(lián)及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：白癜風(fēng)是皮膚科常見的獲得性色素脫失性疾病，以皮損部位黑素細(xì)胞明顯減少或消失為特征。黑素細(xì)胞破壞或凋亡的機(jī)理迄今尚未完全闡明，白癜風(fēng)的發(fā)病機(jī)制的研究多集中在自身免疫、神經(jīng)因子、氧化應(yīng)激、代謝毒素、遺傳等學(xué)說。越來越多的學(xué)者認(rèn)為，白癜風(fēng)的發(fā)生和進(jìn)展是多因素多基因共同作用的，其中基因遺傳變異決定個(gè)體罹患白癜風(fēng)的易感性。另外越來越多的研究顯示白癜風(fēng)發(fā)病與氧化應(yīng)激密切相關(guān)，白癜風(fēng)患者皮損區(qū)出現(xiàn)過量H_2O_2的蓄積。 microRNA（miRNA）是約22個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的非編碼小分子RNA，從具有一個(gè)或多個(gè)發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的前體pre-miRNA加工而來。miRNA通過與靶信使RNA（mRNA）的3’非翻譯區(qū)（3’-UTR）結(jié)合對(duì)轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮負(fù)調(diào)節(jié)作用，使mRNA翻譯抑制或降解，在機(jī)體的多種生理和病理過程中有重要作用。有研究顯示人類大約60%編碼蛋白基因受到miRNA的調(diào)控。 單核苷酸多態(tài)性（SNP）是人類基因中最常見的基因變異，可影響基因的表達(dá)、轉(zhuǎn)錄、翻譯、修飾，是疾病易感性和導(dǎo)致藥物反應(yīng)性個(gè)體和種族差異的重要原因之一。研究表明miRNA的SNP與多種人類疾病相關(guān)，可以影響疾病的表型或發(fā)生發(fā)展，目前腫瘤性疾病如肺癌、乳腺癌、肝癌等研究較多，在一些非腫瘤性疾病如小兒先心病、煤工塵肺等中也有研究。明確位于miRNA的SNP是否與白癜風(fēng)的易感性有關(guān)聯(lián)，尋找到與白癜風(fēng)發(fā)生發(fā)展可能相關(guān)的miRNA，初步探討其SNP對(duì)黑素細(xì)胞功能有無影響，可能對(duì)白癜風(fēng)的發(fā)生機(jī)制及臨床治療提供新的理論依據(jù)。 方法： 通過公共miRBase數(shù)據(jù)庫和文獻(xiàn)查找所有miRNA，篩檢并確認(rèn)pre-miRNA中MAF5%的SNP位點(diǎn)及在中國(guó)人群中的分布情況。應(yīng)用分子流行病學(xué)病例-對(duì)照的研究方法，PCR-RFLP的實(shí)驗(yàn)方法，探討miRNA的SNP與白癜風(fēng)易感性的關(guān)聯(lián)性。篩選出與白癜風(fēng)易感性相關(guān)miRNA分子，并構(gòu)建不同基因型miRNA分子的真核表達(dá)質(zhì)粒，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染黑素細(xì)胞PIG1，通過檢測(cè)黑素細(xì)胞活力、凋亡和超微結(jié)構(gòu)變化，觀察miRNA單核苷酸多態(tài)性對(duì)H_2O_2誘導(dǎo)氧化應(yīng)激下黑素細(xì)胞生物學(xué)的影響。之后對(duì)篩檢出的相關(guān)miRNA應(yīng)用生物學(xué)預(yù)測(cè)軟件進(jìn)行靶基因的預(yù)測(cè)，并通過雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miRNA和預(yù)測(cè)靶基因之間的關(guān)系。檢測(cè)轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒組黑素細(xì)胞中黑素合成量和酪氨酸酶活性，以及H_2O_2處理黑素細(xì)胞后各組ROS水平的變化，通過以上功能學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miRNA單核苷酸多態(tài)性對(duì)靶基因的調(diào)控以及黑素細(xì)胞損傷的影響。 結(jié)果： 1.從400個(gè)已知的人類pre-miRNA中確定了課題組研究的4個(gè)miRNA的SNP位點(diǎn)：miR-146a rs2910164，miR-149rs2292832，miR-196a2rs11614913，miR-499rs3746444，在819例白癜風(fēng)病例組及817例對(duì)照組中鑒定出4個(gè)研究位點(diǎn)的基因型，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，具有miR-196a2CC基因型的個(gè)體與TT和TC的聯(lián)合基因型相比白癜風(fēng)的易感性降低。在其它3個(gè)miRNA鑒定的基因型分析結(jié)果中沒有顯示出類似的主效應(yīng)。.對(duì)miR-196a2rs11614913CC基因型與TT和TC聯(lián)合基因型進(jìn)行了分層分析。觀察到白癜風(fēng)易感性的降低主要表現(xiàn)在以下組別中：年齡大于20歲，女性，散發(fā)型白癜風(fēng)，無白癜風(fēng)家族史，不伴有其它自身免疫性疾病，病史超過1年的患者。 2.成功構(gòu)建了miR-196a2的表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1-miR-196a2-T和pCDNA3.1-miR-196a2-C。H_2O_2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激下，CCK-8結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-miR-196a2-T和pCDNA3.1-miR-196a2-C表達(dá)質(zhì)粒組黑素細(xì)胞的活力無顯著性差異。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-miR-196a2-T和pCDNA3.1-miR-196a2-C表達(dá)質(zhì)粒組的黑素細(xì)胞早期凋亡率均有顯著降低（P0.05），并且pCDNA3.1-miR-196a2-C和pCDNA3.1-miR-196a2-T相比凋亡也顯著減少（P 0.05）。透射電鏡下觀察細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染對(duì)照組細(xì)胞顯示明顯的凋亡改變，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-miR-196a2-T表達(dá)質(zhì)粒組細(xì)胞有輕微的凋亡變化，而轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-miR-196a2-C表達(dá)質(zhì)粒組無明顯的凋亡改變。 3.通過生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)出可能與白癜風(fēng)氧化應(yīng)激相關(guān)的miR-196a2靶基因TRP-1，將其作為miRNA-196a2SNP研究的靶基因。成功構(gòu)建了TRP-1的報(bào)告基因質(zhì)粒psiCHECK2-TRP-1。雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)結(jié)果顯示，miR-196a2-T和miR-196a2-C均結(jié)合靶基因TRP-1，從而抑制熒光素酶的表達(dá)，并且miR-196a2-C比miR-196a2-T更加容易和靶基因相結(jié)合（P 0.05）。與轉(zhuǎn)染對(duì)照組pCDNA3.1質(zhì)粒黑素細(xì)胞相比，pCDNA3.1-miR-196a2-C質(zhì)粒組黑素合成量顯著降低（P0.01）。H_2O_2處理后與轉(zhuǎn)染對(duì)照組質(zhì)粒黑素細(xì)胞相比，轉(zhuǎn)染pCDNA3.1-miR-196a2-C表達(dá)質(zhì)粒組黑素細(xì)胞中ROS水平顯著降低（P 0.05）。 結(jié)論： 1.具有miR-196a2CC基因型的個(gè)體與TT和TC的聯(lián)合基因型相比白癜風(fēng)的發(fā)病易感性降低，miR-196a2SNP rs11614913TC可能降低白癜風(fēng)易感性。 2. H_2O_2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激下，，miR-196a2SNP rs11614913TC可減少黑素細(xì)胞的早期凋亡率，對(duì)黑素細(xì)胞凋亡具有保護(hù)作用。 3. TRP-1是miR-196a2的靶基因，并且miR-196a2-C比miR-196a2-T更加容易和它相結(jié)合。miR-196a2SNP rs11614913TC可能通過結(jié)合靶基因TRP-1而降低H_2O_2處理后的ROS水平，從而保護(hù)黑素細(xì)胞的損傷。
【關(guān)鍵詞】：白癜風(fēng) miRNA miR-196a2 單核苷酸多態(tài)性 TRP-1 氧化應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R758.41
【目錄】：

• 縮略語表7-9
• 中文摘要9-13
• Abstract13-18
• 前言18-19
• 文獻(xiàn)回顧19-28
• 1 白癜風(fēng)概述19-24
• 2 microRNA（miRNA）概述24-28
• 實(shí)驗(yàn)一 miR-146a，miR-149，miR-196a2，miR-499 單核苷酸多態(tài)性與白癜風(fēng)的關(guān)聯(lián)性研究28-43
• 1 材料28-29
• 1.1 實(shí)驗(yàn)儀器28
• 1.2 主要試劑28-29
• 2 方法29-34
• 2.1 研究人群及數(shù)據(jù)采集30
• 2.2 調(diào)查表的設(shè)計(jì)及條目定義30-31
• 2.3 血液樣本中基因組 DNA 制備及保存31-32
• 2.4 PCR-RFLP 測(cè)定基因型32-34
• 2.5 質(zhì)量控制及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法34
• 3 結(jié)果34-40
• 3.1 研究對(duì)象的一般特征34-36
• 3.2 電泳結(jié)果和基因型判別36-37
• 3.3 miRNA 位點(diǎn)單核苷酸基因多態(tài)性與白癜風(fēng)易感性的關(guān)系37-40
• 4 討論40-43
• 實(shí)驗(yàn)二 miR-196a2 單核苷酸多態(tài)性對(duì)人黑素細(xì)胞損傷保護(hù)的細(xì)胞生物學(xué)研究43-53
• 1 材料43-44
• 1.1 主要儀器設(shè)備43
• 1.2 主要試劑43-44
• 1.3 細(xì)胞株44
• 2 方法44-48
• 2.1 miR-196a2 表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建44-45
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)45
• 2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染45-46
• 2.4 黑素細(xì)胞活性檢測(cè)46
• 2.5 黑素細(xì)胞凋亡檢測(cè)46-47
• 2.6 透射電鏡觀察不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組黑素細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化47
• 2.7 統(tǒng)計(jì)方法47-48
• 3 結(jié)果48-50
• 3.1 miR-196a2 SNP rs11614913 T>C 對(duì)黑素細(xì)胞活力無顯著影響48
• 3.2 miR-196a2 SNP rs11614913 T>C 可降低黑素細(xì)胞早期凋亡率48-49
• 3.3 miR-196a2 SNP rs11614913 T>C 對(duì)黑素細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響49-50
• 4 討論50-53
• 實(shí)驗(yàn)三 miR-196a2 單核苷酸多態(tài)性對(duì)人黑素細(xì)胞損傷保護(hù)機(jī)制的初步研究53-62
• 1 材料53
• 1.1 主要儀器設(shè)備53
• 1.2 主要試劑53
• 2 方法53-57
• 2.1 預(yù)測(cè)及構(gòu)建 TRP-13’UTR 報(bào)告質(zhì)粒53-54
• 2.2 細(xì)胞培養(yǎng)54-55
• 2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染55
• 2.4 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)55
• 2.5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的黑素合成含量測(cè)定55-56
• 2.6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的酪氨酸酶活性測(cè)定56
• 2.7 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的 ROS 含量測(cè)定56-57
• 3 結(jié)果57-58
• 3.1 miR-196a2 SNP rs11614913 T>C 降低靶基因 TRP-1 的表達(dá)57
• 3.2 miR-196a2 SNP rs11614913 T>C 能降低黑素細(xì)胞的黑素合成量，而對(duì)酪氨酸酶活性沒有影響57-58
• 3.3 miR-196a2 SNP rs11614913 T>C 能降低H_2O_2誘導(dǎo)下黑素細(xì)胞中 ROS 水平58
• 4 討論58-62
• 小結(jié)62-64
• 參考文獻(xiàn)64-79
• 附錄79-82
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果82-83
• 致謝83-84

【參考文獻(xiàn)】

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3 朱秀敏;;細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征與分子機(jī)制研究進(jìn)展[J];中國(guó)老年學(xué)雜志;2011年13期

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1 牛軍州;Foxp3在黑素瘤細(xì)胞中表達(dá)的鑒定及其功能的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2009年

  本文關(guān)鍵詞：miR-196a2單核苷酸多態(tài)性與白癜風(fēng)易感性的關(guān)聯(lián)及機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：298641