研究背景特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一種多因素影響的慢性炎癥性皮膚疾病,主要特征為皮膚干燥,嚴(yán)重瘙癢,紅斑病變。目前發(fā)病機(jī)制尚未明確,免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)異常和表皮屏障缺陷在AD的發(fā)展中起著重要作用。近些年,越來越多的證據(jù)表明,一些新的易感基因與AD患者的表皮屏障功能與先天性和適應(yīng)性免疫有關(guān)。本研究團(tuán)隊(duì)于2011年首次進(jìn)行了中國(guó)漢族人AD全基因組關(guān)聯(lián)分析(genome-wide association,GWAS)研究,發(fā)現(xiàn)了5q22.1區(qū)域是AD新的易感區(qū)域,通過對(duì)該區(qū)域進(jìn)行功能學(xué)分析及生物信息學(xué)預(yù)測(cè),提示該區(qū)域TMEM232基因可能是中國(guó)漢族人群AD的易感基因,通過免疫組織化學(xué)研究發(fā)現(xiàn),在AD和正常組織中TMEM232的蛋白表達(dá)有所不同。研究目的本課題擬通過對(duì)5q22.1區(qū)域的單倍型分析和靶向捕獲測(cè)序研究該區(qū)域的易感基因功能變異,并通過功能學(xué)實(shí)驗(yàn)來初步驗(yàn)證該基因與AD的關(guān)聯(lián)。研究方法課題組共納入3055名漢族AD患者以及4346名對(duì)照,利用前期GWAS數(shù)據(jù)和基因分型信息結(jié)果,提取4個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)和6個(gè)插入缺失(Insertion/deletion,Indel)變異數(shù)據(jù),針對(duì)每個(gè)個(gè)體利用PHASE v 2.1軟件進(jìn)行該區(qū)域的單倍型構(gòu)建,用SPSS 13.0軟件通過卡方檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)病例組和對(duì)照組之間單倍型頻率差異,尋找與AD有關(guān)聯(lián)的單倍型。隨后我們把含有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義最強(qiáng)的單倍型樣本挑選出來,再?gòu)倪@些樣本中篩選高頻率(0.5%頻率)單倍型且盡量篩選純合子,當(dāng)純合子樣本量少可以選擇雜合子,另外再篩選2例不含此單倍型樣本作為參照。接著我們對(duì)挑選出來的樣本在BGISEQ-500測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量靶向區(qū)域捕獲測(cè)序,以找出有意義的基因功能變異;最后進(jìn)一步對(duì)發(fā)現(xiàn)的基因進(jìn)行Ha Ca T細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn),我們將實(shí)驗(yàn)性Ha Ca T細(xì)胞等分為三組:用p CMV6-Entry-gene轉(zhuǎn)染的細(xì)胞,用p CMV6-Entry(Vect)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞和不用DNA轉(zhuǎn)染的細(xì)胞(Con)。然后通過免疫印跡測(cè)量Ha Ca T細(xì)胞中的基因的表達(dá),MTS法評(píng)估細(xì)胞增殖。最后,用1.5m M Ca Cl2處理轉(zhuǎn)染細(xì)胞,然后通過蛋白質(zhì)印跡測(cè)量分化標(biāo)志物INV和LOR探索其對(duì)細(xì)胞增生和分化的影響。研究結(jié)果本研究一共發(fā)現(xiàn)了60種單倍型,8種常見的單倍型分別為H1,H2,H11,H15,H25,H37,H59,H60(頻率0.5%),其中H15單倍型(GA CTG CA TAGCTAAGTACA)與AD顯著相關(guān)(P=2.72E-10,OR=0.14,95%CI=0.07-0.28),在病例中頻率為0.13%,對(duì)照組中為0.95%,病例組頻率明顯低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;我們根據(jù)篩選原則挑出16個(gè)樣本,其中只有1例H15純合子,其他均為雜合子,通過對(duì)樣本進(jìn)行靶向測(cè)序分析未發(fā)現(xiàn)顯著的突變位點(diǎn),但進(jìn)一步的統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)表明在某些功能區(qū)域,僅有基因TMEM232與H15存在統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性(P=7.33E-5,OR=0.33,95%CI=0.19-0.58)。在Ha Ca T細(xì)胞轉(zhuǎn)染功能實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)在構(gòu)建過表達(dá)載體p CMV6-Entry-TMEM232(TMEM232)質(zhì)粒組的細(xì)胞活力比在質(zhì)粒空載體p CMV6-Entry(Vect)組以及用無DNA轉(zhuǎn)染(Con)組的細(xì)胞活力低(所有P0.05)。此外,我們發(fā)現(xiàn)在Ca2+刺激的條件下,與Vect和Con組相比,TMEM232抑制內(nèi)披蛋白(Involucrin,INV)和兜甲蛋白(Loricrin,LOR)的表達(dá)(均P0.05)。研究結(jié)論本研究驗(yàn)證了H15單倍型與AD的相關(guān)性,揭示TMEM232基因可能在AD中發(fā)揮著重要作用。且TMEM232的過表達(dá)抑制Ha Ca T細(xì)胞的體外增殖和分化。
【學(xué)位單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：R758.2
【部分圖文】：

2 5q22.1 區(qū)域 10 驗(yàn)證位點(diǎn) LD 圖ig 2 The LD diagram of ten variants in 5q22.1 region..5.6 Target Capture Sequencing二代測(cè)序.5.6.1 測(cè)序樣本選擇本次測(cè)序?qū)嶒?yàn)要求DNA濃度≥20ng/ul，體積40ul以上。我們參考目前提取NA樣本質(zhì)量，計(jì)劃挑選階段進(jìn)入5q22.1區(qū)域內(nèi)的常見的單倍型樣本用于進(jìn)一步(位點(diǎn)選擇及單倍型構(gòu)建見下面步驟)。樣本篩選有以下幾個(gè)步驟：首先，把各本的單倍體基因型列出來，優(yōu)先選擇出含最具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的單倍型的樣本次，我們從這些樣本中篩選含單倍型頻率較高的樣本，以確保表示每個(gè)高頻> 0.5％）單倍型都包括進(jìn)去；第三，我們盡量篩選純合子，當(dāng)沒有足夠數(shù)量合子時(shí)，也可以選擇部分雜合子。

圖 4 TMEM232 在 HaCaT 中的表達(dá)情況Fig 4 The expression of TMEM232 in HaCaT cellsCon：HaCaT 細(xì)胞；Vect：用 pCMV6-Entry 轉(zhuǎn)染的 HaCaT 細(xì)胞。與 Con 和 Vect 組相比，TMEM232組中 TMEM232 蛋白表達(dá)豐富，P <0.05。3.7.2 TMEM232基因過表達(dá)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)為了確定TMEM232的過表達(dá)是否影響HaCaT細(xì)胞的生長(zhǎng)，我們進(jìn)行了MTS測(cè)定實(shí)驗(yàn)以評(píng)估細(xì)胞增殖。通過比較細(xì)胞孵育2小時(shí)后，3組細(xì)胞在390nm處的吸光度來分析細(xì)胞活力。數(shù)據(jù)顯示TMEM232組的細(xì)胞活力分別低于Con和Vect組（均P<0.05）（圖5）。

TMEM232 在 HaCaT 中的表達(dá)情況 The expression of TMEM232 in HaCaT cellsHaCaT 細(xì)胞；Vect：用 pCMV6-Entry 轉(zhuǎn)染的 HaCaT 細(xì)胞 TMEM232 蛋白表達(dá)豐富，P <0.05。 TMEM232基因過表達(dá)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)為了確定TMEM232的過表達(dá)是否影響HaCaT細(xì)驗(yàn)以評(píng)估細(xì)胞增殖。通過比較細(xì)胞孵育2小時(shí)后析細(xì)胞活力。數(shù)據(jù)顯示TMEM232組的細(xì)胞活5）（圖5）。
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