目的:在腫瘤中,MHCⅠ類分子提呈腫瘤相關抗原TAA給CD8~+T細胞,在其免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用。腫瘤細胞表面MHCⅠ類分子表達的下調甚至缺失是腫瘤細胞發(fā)生免疫逃逸的最重要的原因之一。因此,研究提高腫瘤細胞表面MHCⅠ類分子表達的手段及其調節(jié)機制,對于腫瘤的治療具有重要意義。黑素瘤是一種惡性的皮膚腫瘤,因其高度惡性,多發(fā)轉移以及預后較差而為人所熟知。二甲雙胍(metformin,以下簡稱Met)作為新發(fā)現的抗癌藥物,能夠抑制黑素瘤細胞的繁殖、運動與侵襲。但其抗癌機制尚不明確,仍需進一步的研究。本實驗將研究二甲雙胍對B16F10黑素瘤細胞表面MHCⅠ類分子表達的調節(jié)作用,并通過ERK信號通路激活劑佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯(PMA)的反證,來驗證該調節(jié)依賴于二甲雙胍對ERK信號通路的抑制。研究結果將為MHCⅠ類分子表達的調節(jié)機制提供新依據,為二甲雙胍的抗癌機制提供新思路。方法:1細胞來源:本實驗使用的小鼠B16F10(H-2~b)黑素瘤細胞來源于承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院中心實驗室。2實驗分組與干預:本實驗分為兩階段,第一階段使用二甲雙胍干預細胞24h,根據濃度分為空白對照組,2.5 mM Met組,5 mM Met組,10mM Met組和20 mM Met組;第二階段使用二甲雙胍和/或PMA干預細胞24h,因PMA需溶于二甲基亞砜(DMSO)后方能在培養(yǎng)基中溶解,為排除DMSO的影響,所以此階段分組中均含1%DMSO。根據干預藥物種類和濃度分為空白對照組(1%DMSO組),10 mM Met+1%DMSO組,20 mM Met+1%DMSO組(僅蛋白質免疫印跡實驗中含),0.125μM PMA組,10 mM Met+0.125μM PMA組。3采用流式細胞術測量兩階段各組中B16F10細胞表面H-2D~b和H-2K~b(B16F10(H-2~b)細胞表面最重要的兩種MHCⅠ類分子)的表達量。4采用實時熒光定量反轉錄PCR(RT-qPCR)技術檢測兩階段各組中B16F10細胞內H-2D~b和H-2K~b的基因轉錄水平表達。5采用蛋白質免疫印跡(western blot)技術測量B16F10細胞內ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表達量。6統計學分析:采用SPSS19.0軟件統計分析并以?x±s表示計量資料,采用單因素方差分析,用用SNK-q檢驗進行組間的兩兩比較,檢驗水準a=0.05。結果:1.二甲雙胍能夠抑制B16F10細胞內p-ERK1/2的蛋白質表達,對ERK1/2的蛋白質表達無影響Western blot結果顯示,經等比濃度的二甲雙胍(2.5,5,10,20 mM)處理24h后,與空白對照組相比,B16F10細胞內p-ERK1/2的蛋白質相對表達量(of control)呈先降低后升高的變化趨勢。經單因素方差分析,P0.01,組間差異有統計學意義。經SNK-q檢驗,組間兩兩比較,差異均具有統計學意義(P0.05)。可見,二甲雙胍可以抑制B16F10細胞內p-ERK1/2的蛋白質表達,且最適濃度出現在10 mM左右。經過24h的相同處理,與空白對照組相比,各實驗組B16F10細胞內ERK1/2的蛋白質相對表達量(of control)無明顯變化,P0.05,組間差異無統計學意義。可見,二甲雙胍對B16F10細胞內ERK1/2的蛋白質表達無影響。2.PMA提高B16F10細胞內p-ERK1/2的蛋白質表達,對ERK1/2的蛋白質表達無影響Western blot結果顯示,經0.125μM PMA處理24h后,與空白對照組(1%DMSO組)相比,B16F10細胞內p-ERK1/2的蛋白質相對表達量(of control)明顯升高。經SNK-q檢驗,P0.05,兩組間差異有統計學意義�？梢�,PMA提高B16F10細胞內p-ERK1/2的蛋白質表達。經相同處理24h后,與空白對照組(1%DMSO組)相比,實驗組B16F10細胞內ERK1/2的蛋白質相對表達量(of control)無明顯變化,兩組間差異無統計學意義(P0.05)。可見,PMA對B16F10細胞內ERK1/2的蛋白質表達無影響。3.二甲雙胍抑制經PMA上調的B16F10細胞內p-ERK1/2的蛋白質表達,對ERK1/2的蛋白質表達無影響Western blot結果顯示,經10 mM Met+1%DMSO和20 mM Met+1%DMSO處理24h后,與空白對照組(1%DMSO組)相比,B16F10細胞內p-ERK1/2的蛋白質相對表達量(of control)明顯降低,P0.05,組間差異有統計學意義。但兩實驗組間差異并無統計學意義(P0.05)�？梢�,當1%DMSO存在時,二甲雙胍仍可抑制B16F10細胞內p-ERK1/2的蛋白質表達,但不同濃度間的抑制作用差異可能有所變化。此時,B16F10細胞內ERK1/2的蛋白質相對表達量(of control)無明顯變化,兩實驗組與對照組間差異無統計學意義(P0.05)�？梢�,當1%DMSO存在時,二甲雙胍對B16F10細胞內ERK1/2的蛋白質表達無影響。經10 mM Met+0.125μM PMA處理24h后,與0.125μM PMA組相比,B16F10細胞內p-ERK1/2的蛋白質相對表達量(of control)明顯降低,P0.05,組間差異有統計學意義�？梢�,二甲雙胍能夠抑制經PMA上調的B16F10細胞內p-ERK1/2的蛋白質表達。此時,B16F10細胞內ERK1/2的蛋白質相對表達量(of control)無明顯變化,兩組間差異無統計學意義(P0.05)�？梢�,二甲雙胍對PMA處理后的B16F10細胞內ERK1/2的蛋白質表達并無影響。4.二甲雙胍上調B16F10細胞表面H-2D~b和H-2K~b的表達流式細胞術結果顯示,經等比濃度的二甲雙胍(2.5,5,10,20 mM)處理24h后,與空白對照組相比,H-2D~b和H-2K~b陽性的細胞比例均呈峰樣變化。經單因素方差分析,P0.01,組間差異有統計學意義。經SNK-q檢驗,組間兩兩比較,除空白對照組與2.5 mM Met組的細胞表面H-2K~b的表達差異無統計學意義外(P0.05),其它組間兩兩比較,差異均具有統計學意義(P0.05)。可見,二甲雙胍能夠上調B16F10細胞表面H-2D~b和H-2K~b的表達,且最適濃度出現在10 mM左右。5.PMA降低B16F10細胞表面H-2D~b和H-2K~b的表達流式細胞術結果顯示,經0.125μM PMA處理24h后,與空白對照組(1%DMSO組)相比,H-2D~b和H-2K~b陽性的細胞比例均降低。經SNK-q檢驗,P0.05,組間差異有統計學意義�？梢�,PMA降低B16F10細胞表面H-2D~b和H-2K~b的表達。6.二甲雙胍上調經PMA抑制的B16F10細胞表面H-2D~b和H-2K~b的表達流式細胞術結果顯示,經10 mM Met+1%DMSO處理24h后,與空白對照組(1%DMSO組)相比,B16F10細胞表面H-2D~b和H-2K~b的表達均明顯升高,P0.05,組間差異有統計學意義。可見,當1%DMSO存在時,二甲雙胍仍可提高B16F10細胞表面H-2D~b和H-2K~b的表達。經10 mM Met+0.125μM PMA處理24h后,與0.125μM PMA組相比,H-2D~b和H-2K~b陽性的細胞比例均升高,P0.05,組間差異有統計學意義。可見,二甲雙胍能夠上調經PMA抑制的B16F10細胞表面H-2D~b和H-2K~b的表達。7.二甲雙胍上調B16F10細胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達RT-qPCR結果顯示,經二甲雙胍(5,10,20 mM)處理24h后,與空白對照組相比,B16F10細胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達均升高,P0.05,組間差異有統計學意義�？瞻讓φ战M與2.5 mM Met組之間,10 mM Met與20 mM Met組之間,B16F10細胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達差異均無統計學意義(P0.05)。可見,二甲雙胍能夠上調B16F10細胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達。8.PMA降低B16F10細胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達RT-qPCR結果顯示,經0.125μM PMA處理24h后,與空白對照組(1%DMSO組)相比,B16F10細胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達均降低,P0.05,組間差異有統計學意義�？梢�,PMA能夠降低B16F10細胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達9.二甲雙胍上調經PMA抑制的B16F10細胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達RT-qPCR結果顯示,經10 mM Met+1%DMSO處理24h后,與空白對照組(1%DMSO組)相比,B16F10細胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達均明顯升高,P0.05,組間差異有統計學意義�？梢�,當1%DMSO存在時,二甲雙胍仍可提高B16F10細胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達。經10 mM Met+0.125μM PMA處理24h后,與0.125μM PMA組相比,B16F10細胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達均升高,P0.05,組間差異均有統計學意義�？梢�,二甲雙胍能夠上調經PMA抑制的B16F10細胞H-2D~b和H-2K~b的mRNA表達。結論:1.ERK信號通路能夠調節(jié)B16F10細胞MHCⅠ類分子的表達。2.二甲雙胍通過抑制ERK信號通路上調B16F10黑素瘤細胞表面MHCⅠ類分子的表達。
【學位單位】：承德醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：R739.5
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
英文縮寫
前言
材料與方法
結果
附圖
討論
結論
參考文獻
綜述
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致謝
個人簡歷

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本文編號：2829966