目的:為研究以hIL-24基因構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-21a(+)/ hIL-24在大腸桿菌中表達(dá)及其部分純化、復(fù)性得到的蛋白產(chǎn)物——重組人白介素24(rhIL-24)對A375黑色素瘤細(xì)胞體內(nèi)外的抗腫瘤效應(yīng)及其分子機(jī)理。 方法:以原核表達(dá)載體pBV220-hIL-24為模板構(gòu)建新的pET-21a(+)/hIL-24重組原核表達(dá)載體系統(tǒng),并在大腸桿菌中獲得高效表達(dá),將表達(dá)產(chǎn)物純化、復(fù)性后得到初步純化的rhIL-24,經(jīng)Western-blot方法鑒定后,用rhIL-24刺激PBMC,收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清,用ELISA方法檢測PBMC分泌的IL-6、IFN-γ、TNF-α的含量。用rhIL-24作用于體外培養(yǎng)的人A375黑色素瘤細(xì)胞,用MTT法去評價rhIL-24對A375細(xì)胞生長的影響,繪制出細(xì)胞生長曲線;通過流式細(xì)胞術(shù)(FCM),熒光染色等檢測rhIL-24對A375細(xì)胞生長周期和凋亡的影響。用rhIL-24作用于雞胚尿囊膜(CAM),觀察其對血管新生的影響。在裸鼠真皮下建立人A375細(xì)胞黑色素瘤動物模型后,用rhIL-24治療,測量瘤體的體積及重量以檢測rhIL-24等對瘤體生長的抑制作用。用免疫組化檢測腫瘤組織中的BAX、BCL-2、CD34及VEGF的表達(dá)情況,以確認(rèn)經(jīng)rhIL-24治療后腫瘤細(xì)胞生長是否受到抑制及腫瘤組織血管新生是否減少。 結(jié)果:經(jīng)PCR及酶切產(chǎn)物電泳證實所克隆的基因長度與理論值接近,經(jīng)序列測定證實所克隆的基因與GenBank報道的hIL-24序列完全一致,為474bp。構(gòu)建的原核表達(dá)載體pET-21a(+)/ hIL-24,經(jīng)雙酶切和PCR鑒定,原核表達(dá)載體構(gòu)建正確。pET-21a(+)/ hIL-24轉(zhuǎn)染的BL21宿主菌誘導(dǎo)表達(dá)后裂解菌體、提取包涵體的內(nèi)容物,再進(jìn)行SDS-PAGE電泳,有一條18.5KD左右的蛋白條帶出現(xiàn),與理論值一致。Western-blot檢測該產(chǎn)物能與IL-24抗體形成特異性條帶。含pET-21a(+)/ hIL-24的宿主菌BL21經(jīng)異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)后,rhIL-24在大腸桿菌中獲高效表達(dá)。初步純化的rhIL-24能刺激PBMC增加IL-6、IFN-γ及TNF-α的分泌, 72
【學(xué)位單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2006
【中圖分類】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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1 葉震敏,朱曄涵,盛偉華,繆競誠,危少華,吳康,楊吉成;人白介素24重組蛋白的表達(dá)及其抗腫瘤機(jī)理的研究[J];生物工程學(xué)報;2005年05期

2 李曉麗,王世軍;加味保安方對雞胚尿囊膜血管新生的影響[J];中國微循環(huán);2005年04期

3 馬群風(fēng),江紅,劉錕,朱捷,鄭曉飛;Mda7/IL-24基因的克隆及其融合蛋白在E.coli中的表達(dá)[J];軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院院刊;2004年03期

4 王世軍,孫靜,張棟,郭繼龍,簡隆磊,劉鎧;雞胚尿囊膜血管生長的特點及觀測方法[J];生物醫(yī)學(xué)工程研究;2004年01期

5 陳雄艷,李麗娥,盛偉華,龔愛華,繆競誠,楊吉成;人白細(xì)胞介素-24基因的克隆及序列測定[J];蘇州大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2003年03期

6 鄭江紅,林子豪;皮膚惡性黑色素瘤治療的進(jìn)展[J];中華整形外科雜志;2003年01期

7 吳一凡,張雙全,高秀玉,劉曉宇;乳糖誘導(dǎo)pET載體表達(dá)重組蛋白的研究[J];南京師大學(xué)報(自然科學(xué)版);2002年01期

8 武利存,宋守芹,王麗,張維東,孫公甲;平陽霉素對雞胚絨毛尿囊膜血管內(nèi)皮細(xì)胞生長的影響[J];細(xì)胞生物學(xué)雜志;2001年02期

本文編號：2813250