【摘要】：研究背景 掌跖角化病(Palmoplanter keratoderma,PPK)又稱掌跖角皮病,是掌跖部皮膚異常增厚、角化過度為特點(diǎn)的一類慢性皮膚病。臨床上,根據(jù)有無家族史,可將其分為遺傳性和獲得性。前者可表現(xiàn)為顯性、隱性或X連鎖遺傳;根據(jù)組織病理學(xué)特征,將其分為表皮松解型、非表皮松解型、汗孔角化型掌跖角化病;根據(jù)皮損形態(tài)將其分為彌漫性、局灶性、條紋狀、點(diǎn)狀掌跖角化病。點(diǎn)狀掌跖角化病(Punctate palmoplanter keratoderma,PPPK),人類孟德爾遺傳在線(Online Mendelian inheritance in Man database,OMIM)編號(hào) 148600,是一種以掌跖部不規(guī)則分布、進(jìn)行性加重的角化性丘疹為特征的常染色體顯性遺傳性皮膚病。PPPK影響患者身心健康和生活質(zhì)量,目前尚無有效根治方法。探索PPPK發(fā)病規(guī)律、尋找PPPK致病基因是現(xiàn)階段該病研究熱點(diǎn)。對(duì)于致病基因明確的單基因病,對(duì)已知致病基因進(jìn)行直接測(cè)序就可以找到致病突變位點(diǎn)。截止目前,已報(bào)道38個(gè)α/γ-銜接蛋白結(jié)合蛋白(Alpha-and gamma-adaptin binding Protein,AAGAB)基因突變位點(diǎn)和 1 個(gè) XIV 型膠原纖維 α1鏈基因(Collagen Type XIV Alpha 1 Chain,COL14A1乃突變位點(diǎn)與PPPK發(fā)病有關(guān),其中COL14A1基因突變致病性尚有待于進(jìn)一步蛋白質(zhì)功能學(xué)研究證實(shí)和候選基因重復(fù)性驗(yàn)證。此外,仍有部分報(bào)道中國(guó)漢族人PPPK家系未發(fā)現(xiàn)上述相關(guān)致病突變位點(diǎn)。這說明PPPK可能存在遺傳異質(zhì)性,即該病除上述致病基因之外,可能還存在其他致病基因。人類外顯子組序列僅占人類整個(gè)基因組1%,在已發(fā)現(xiàn)的人類單基因遺傳病中,約85%致病突變都位于這1%的蛋白質(zhì)編碼序列。對(duì)于有遺傳異質(zhì)性或致病基因不明的單基因病,全外顯子組測(cè)序是目前尋找其致病基因的最有效手段。目的(1)分析一個(gè)中國(guó)漢族人點(diǎn)狀掌跖角化病家系臨床表型及遺傳學(xué)特征;(2)尋找其致病基因,提供疾病及遺傳咨詢。方法(1)收集來自安徽省銅陵市一個(gè)漢族人PPPK家系。通過家系調(diào)查,分析其臨床表型及遺傳學(xué)特征。同時(shí),家系采集小組抽取第二、第三代所有家系成員靜脈血各4ml抗凝處理后,超低溫冰箱保存。(2)提取基因組DNA;設(shè)計(jì)AAGAB基因10個(gè)外顯子10對(duì)引物;聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增家系患者AAGAB基因10個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列,對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序。(3)若該家系患者AAGAB基因編碼區(qū)未發(fā)現(xiàn)致病突變位點(diǎn),進(jìn)一步采用全外顯子組測(cè)序技術(shù)尋找該家系致病基因:①選取家系內(nèi)臨床表型顯著且嚴(yán)重程度相近2名患者(Ⅱ2和Ⅱ5)外周靜脈血,提取基因組DNA;②將基因組DNA隨機(jī)打斷、末端修復(fù)、連接,制備線性文庫(kù);③制備成雜交文庫(kù);④基因組DNA全外顯子組捕獲、富集,對(duì)富集后片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增;⑤PCR產(chǎn)物進(jìn)行高通量測(cè)序;⑥使用Il1umina堿基識(shí)別軟件讀取原始圖像文件;⑦使用Burrows-Whee1erAligner軟件與人類參考基因組(GRCh37/HG19)進(jìn)行比對(duì);⑧使用 GATK(v3.3.0)HaplotypeCaller 軟件識(shí)別基因組單核苷酸變異(Single nucleotide varians,SNVs)和插入缺失(Insertion and Deletions,InDels)變異;⑨通過與dbSNP庫(kù)、1000 Genomes及病例共有等方式進(jìn)行比對(duì),過濾掉常見SNVs和InDels(去除dbSNP庫(kù)、1000 Genomes等數(shù)據(jù)庫(kù)中次等位頻率=1%SNVs/InDels);同時(shí)鑒別SNVs和InDels是否導(dǎo)致蛋白編碼發(fā)生變化和氨基酸發(fā)生改變;或者編碼區(qū)非同義突變SNVs的SIFT(Sorting Intolerant From Tolerant)值是否小于 0.05,或者 Polyphen(Polymorphism Phenotyping)軟件預(yù)測(cè)氨基酸改變對(duì)蛋白質(zhì)生物學(xué)功能的影響是否有害。(4)選取2名患者共有、與皮膚代謝有關(guān)的罕見或新發(fā)變異位點(diǎn)為該家系候選突變位點(diǎn)。對(duì)全外顯子組測(cè)序鑒定出的候選突變位點(diǎn),設(shè)計(jì)引物;分別對(duì)家系內(nèi)另外3例患者和第二、三代正常成員及120名50歲以上來我院健康體檢的正常人基因組DNA目標(biāo)位點(diǎn)及上下游區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增;PCR產(chǎn)物純化后,DNA測(cè)序;將測(cè)序結(jié)果在家系內(nèi)進(jìn)行基因型-表型共分離分析。結(jié)果(1)臨床表型特征:該家系PPPK患者均在25歲左右發(fā)病;起初皮疹表現(xiàn)為針頭大小、淡黃色、半透明的角化性丘疹,隨年齡增長(zhǎng),皮疹數(shù)量多、體積增大,嚴(yán)重者角化性丘疹融合成斑塊,以掌跖著力處最為顯著;雙足跖處皮損明顯重于雙手掌;雙手掌心和雙足弓內(nèi)側(cè)等非著力處皮損較輕或缺如;第二代患者皮損明顯重于第三代;同輩患者中,勞動(dòng)強(qiáng)度大者,皮損癥狀重。(2)該家系4代,共34人,患者6例,其中男性3例,女性3例,連續(xù)3代均有發(fā)病,符合常染色體顯性遺傳模式。(3)該家系患者AAGAB基因10個(gè)外顯子及其側(cè)翼序列未發(fā)現(xiàn)致病突變位點(diǎn)及單核苷酸多態(tài)性位點(diǎn)。(4)全外顯子組測(cè)序結(jié)果顯示,樣品Ⅱ2平均測(cè)序深度137.51,覆蓋度99.79%,測(cè)序深度≥20x目標(biāo)區(qū)域的覆蓋度97.89%;樣品Ⅱ5平均測(cè)序深度148.03,覆蓋度99.71%,測(cè)序深度≥20x目標(biāo)區(qū)域的覆蓋度97.76%。經(jīng)過數(shù)據(jù)過濾和比對(duì),篩選出兩者共有的位于編碼區(qū)和剪切位點(diǎn)的罕見和新發(fā)SNVs和InDels變異數(shù)分別為40和60個(gè)。對(duì)以上100個(gè)變異位點(diǎn)進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)、功能及致病性進(jìn)行具體分析。其中與皮膚代謝有關(guān)的3個(gè)罕見及新發(fā)變異位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)基因名稱分別為FLG基因(NM_002016.1:c.1333_1334insCCCA →p.Leu445Arg446)、HRNR基因(M_001009931.2:c.8292_8293insCT→p.Ala2764Gly2765)、CELA1基因(NM_001971,5:c.419delC→р.Ala140Val)。Sanger法DNA測(cè)序證實(shí)該家系內(nèi)患者攜帶糜蛋白酶樣彈力蛋白酶 1(Chymo-trypsin like elastase family member 1,CLA1)基因第 5 外顯子с.419delC雜合移碼突變,正常家系成員及120名正常人均不攜帶該突變,符合基因型與表型共分離。結(jié)論(1)本研究PPPK家系患者皮損嚴(yán)重程度與后天因素尤其是掌跖部位長(zhǎng)期摩擦、刺激、受力等有關(guān)。(2)本研究家系遺傳方式符合常染色體顯性遺傳。(3)本研究家系PPPK發(fā)病與AAGAB基因編碼區(qū)突變無關(guān)聯(lián);PPPK存在其他致病基因。(4)CELA1基因c.419delC雜合移碼突變可能是本研究家系致病變異位點(diǎn)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R758.5
【圖文】：

圖１全外顯子組測(cè)序信息分析流程逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ｔｈｅ邋ｗｈｏｌｅ邋ｅｘｏｍｅ邋ｓｅｑｕｅｎｃｉｎ呂邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｐｉｐｅｌｉｎｅ逡逑．３．邋５變異位點(diǎn)致病性分析逡逑突變不引起編碼氨基酸的改變，移碼突變和無義突變可Ｗ導(dǎo)致大片段蛋碼異常，造成蛋白質(zhì)功能學(xué)改變。非同義突變可＾心引起蛋白質(zhì)單個(gè)或多酸改變，對(duì)整體蛋白質(zhì)功能影響作用有待評(píng)估。目前可Ｗ通過ＳＩＦＴ（Ｓｏｒｔｈｌｅｒａｎｔ邋Ｆｒｏｍ邋Ｔｏｌｅｒａｎｔ），邋Ｐｏｌｙｐｈｅｎ邋（Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ邋Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ）等功能學(xué)預(yù)測(cè)軟同義變異進(jìn)行功能學(xué)預(yù)測(cè)。ＳＩＦＴ是基于序列同源性和氨基酸的物理性質(zhì)白質(zhì)中某個(gè)氨基酸替換是否影響該蛋白功能的軟件。為了評(píng)估氨基酸替

圖２先證者雙手掌、巧足郎部皮損逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２邋Ｓｋｉｎ邋ｌｅｓｉｏｎｓ邋ｏｖｅｒ邋ｔｈｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ｏｆ邋化ｅ邋ｐｒｏｂａｎｄ’ｓ邋ｐａｌｍｓ邋ａｎｄ邋ｓｏｌｅｓ逡逑２５逡逑

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