【摘要】： 目的:腫瘤的發(fā)生不僅與細胞的異常增殖和分化有關(guān),也與細胞凋亡的異常有關(guān)。凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosi s protein,IAP)是一類內(nèi)源性細胞抑制因子,其過度表達引起凋亡不足與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。因此以IAP為靶點,尋找治療惡性腫瘤的新途徑,成為當今腫瘤基因治療的研究熱點。Livin是IAP家族成員之一,Vucic等因該基因在人黑色素瘤細胞中高表達,又稱之為ML-IAP(melanomaIAP),特異的分布于多種腫瘤組織,與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、預后及耐藥相關(guān),將可能成為腫瘤治療的潛在靶點。本實驗擬構(gòu)建針對人livin基因的小干擾RNA表達載體,觀察對人惡性黑素瘤A375細胞凋亡和周期的影響,為探索惡性黑素瘤的基因治療提供實驗依據(jù)。方法:研究對象為人惡性黑素瘤A375細胞株。采用:(1)基因克隆技術(shù)構(gòu)建pGPU6-GFP-livin-shRNA表達載體。(2)通過培養(yǎng)A375細胞、細胞轉(zhuǎn)染,利用熒光顯微鏡觀察pGPU6-GFP-livin-shRNA在細胞內(nèi)的表達。(3)分別獲取子組(空白組、脂質(zhì)體組、陰性對照組、實驗組1、實驗組2)總RNA,采用熒光定量PCR技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染前后livin mRNA的表達變化情況。(4)通過細胞轉(zhuǎn)染,用流式細胞術(shù)(FCM)檢測A375細胞的凋亡情況。(5)PI單染流式細胞術(shù)檢測細胞周期情況。結(jié)果:(1)采用基因克隆技術(shù)成功構(gòu)建pGPU6-GFP-livin-shRNA表達載體,并通過脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染人惡性黑素瘤A375細胞株,在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光。(2)熒光定量PCR結(jié)果顯示:實驗組1和實驗組2的A375細胞在轉(zhuǎn)染后48h livin mRNA表達量分別下降了17%和42%,轉(zhuǎn)染后72h livin mRNA表達量分別下降了71%和61%,48h到72h干擾片段的沉默效應呈增強趨勢。(3)流式細胞術(shù)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后48h A375細胞凋亡率:實驗組1和實驗組2(31.00±2.25%和34.72±1.29%)高于空白組(3.21±2.10%)(P＜0.05),脂質(zhì)體組和陰性對照組(7.67±1.34%和6.84±1.34%)與空白組相比無差異(P＞0.05);轉(zhuǎn)染后72h A375細胞凋亡率:實驗組1和實驗組2(34.90±1.71%和38.59±1.31%)高于空白組(3.87±3.04%)(P＜0.05),陰性對照組和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組(7.44±1.69%和7.89±1.44)與空白組相比無差異(P＞0.05)。(4)PI單染流式細胞術(shù)結(jié)果顯示:轉(zhuǎn)染后48h,shRNA-2可引起G_0/G_1期細胞數(shù)升高,S期細胞數(shù)下降,siRNA-1作用不明顯,轉(zhuǎn)然后72h shRNA-1、2均能引起引起G_0/G_1期細胞數(shù)升高,S期細胞數(shù)下降。結(jié)論:(1)設(shè)計出針對livin共有序列的發(fā)卡樣shRNA寡核苷酸片段。(2)成功構(gòu)建出針對livin的shRNA表達載體pGPU6-GFP-livin-shRNA-1、pGPU6-GFP-livin-shRNA-2。(3)shRNA-1和2均能減少A375細胞中l(wèi)ivin mRNA的表達。(4)shRNA-1和2均能促進A375細胞凋亡。(5)shRNA-1和2均能使A375細胞周期出現(xiàn)G_0/G_1期阻滯,細胞增殖受到抑制,但調(diào)控細胞周期的作用時間點不同。
【學位授予單位】：遵義醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R739.5
【圖文】：

圖2.4.2pGPU6一即一shRNA載體的構(gòu)建圖譜Figure2.4.2PGPU6{FP一shRNAveetormaP2.4.2所示:pGpU6一GFp載體共有5117飾，BamHx位于第1663位堿基，萬bsl位于第172BamHI/Bbsl雙酶切后，在T4DNA連接酶的作用下，shR到A寡核昔酸模板連接于pGPu載體。重組體的轉(zhuǎn)化取8釁的稀釋后連接體系與100貝己制備的感受態(tài)細胞TMIOg，輕旋混勻，冰in，45oC熱沖擊1.smin，然后快速置于冰上lmin，加800林1sOC培養(yǎng)基混勻，震蕩培養(yǎng)lh，400Orpm室溫下離心smin，棄上清約800貝后余液與細菌吹打00川涂布在含卡那霉素的LB平板上。將培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)箱放置lh后待菌液倒置平皿，培養(yǎng)過夜。重組體的篩選

畢業(yè)論文shRNA沉默livin基因?qū)θ藧盒院诮Y(jié)果體的酶切鑒定GFP共有5117bp，BamHl位于1663bp，BbslsllRNA編碼區(qū)取代)，所得質(zhì)粒用BamHl，Bb、BamHl和Bbsl切開，而不能被Pstl切開(圖123M45

圖2.1pGPu6一GFP一hvin插入序列測序結(jié)果Figure2.1PGPU6一(;FP一livinsequeneinginsertionsequenee1工V立n1主v立n31即AtarqConsenSU3TCCCTCCATGGGACCTAA............……qaCagtgCcaagtgcCtqc圖2.2pGpU6一GFp一livin插入序列BLAsTL匕對結(jié)果Figure2.2pGpU6一GFp一livininsertionsequeneeonBLASTresults2.2顯示sllRNA的靶序列通過BLAST與Genbank記錄的人livin一cDNA序列比較，結(jié)果一細胞轉(zhuǎn)染組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A375細胞，熒光顯微鏡下觀察如圖3.1

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本文編號：2751931