【摘要】：目的:初步探討雷帕霉素在不同濃度和不同孵育時間下,對人角質形成細胞系HaCaT細胞自噬的誘導效應及其分子機制。方法:不同濃度雷帕霉素處理HaCaT細胞4 h或12 h后,利用四甲基偶氮唑鹽(MTT)方法檢測雷帕霉素對細胞活力的影響,并提取蛋白進行蛋白印跡實驗,檢測LC3-Ⅱ表達水平,作為自噬的檢測方法;通過透射電鏡分析自噬體形成,確認雷帕霉素對自噬的誘導效果。檢測自噬調控上游關鍵元件哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)蛋白表達及其se~(2481)和ser~(2448)磷酸化產物水平,分析mTOR活性;并分析自噬調控下游的另一關鍵基因Atg7的表達,初步分析雷帕霉素誘導HaCaT細胞的分子機制。結果:不同濃度雷帕霉素處理4 h,對HaCaT細胞的活力沒有顯著的影響。高劑量雷帕霉素(80 nmol/L和100 nmol/L)在處理12 h后對HaCaT細胞的活力產生毒性效應。20 nmol/L和50 nmol/L雷帕霉素孵育4 h誘導HaCaT細胞LC3-Ⅱ表達上調,而20 nmol/L和50 nmol/L雷帕霉素孵育12 h仍具有誘導效應。相較于其他濃度,在50 nmol/L雷帕霉素孵育誘導的LC3-Ⅱ表達上調效應最為顯著,并且在藥物孵育4h時超微結構水平誘導產生胞質內大量自噬體形成。1~50nmol/L濃度的雷帕霉素孵育4 h或12 h均可誘導HaCaT細胞mTOR ser~(2481)和mTOR ser~(2448)磷酸化產物水平降低:然而Atg7表達不能觀測到顯著的差異。結論:50 nmol/L雷帕霉素孵育4 h具有顯著的誘導HaCaT細胞自噬效應。HaCaT細胞mTOR分子對雷帕霉素處理敏感,可被其誘導產生蛋白活化抑制效應。這種mTOR信號抑制可能參與了雷帕霉素對HaCaT細胞的自噬誘導效應,但Atg7沒有參與這種調控效應。
【圖文】：

70 臨床皮膚科雜志2014年43卷第5期JClinDermatol,May2014,Vol.43,No.5：二…7-i—-i289 —mTOR S+p2448) i289?_mTOR mKm-?:SB78Atg-7 fSm f16 LC3-I ffi,二Q\0？14 —?—| m451 ra,"n 理HP?>_、取1：空白對照,2:DMSO，3:lnmol/L雷帕霉素， A、B:細胞全景圖(xl500)，C、D:左側細胞的4:5nmol/L雷帕霉素,5：10nmol/L雷帕霉素， 局部放大圖，部分囊泡內可見皺縮損傷的線6：20nmol/L雷帕霉素,7：50nmol/L雷帕霉素 粒體結構(x6000)圖1雷帕霉素孵育HaCaT細胞4h的 圖350nmol/L雷帕霉素處理HaCaT蛋白表達和磷酸化分析 細胞4h后自噬體形成電鏡圖像等[15]的研究表明，雷帕霉素可以誘導WRN缺陷的人ku1234567 成纖維細胞自噬，并且可以減低DNA損傷聚集和促2891?一nS^mT0R 進細胞生長。此外,Xiao等M利用深二度燒傷模型大鼠==^,mR 研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可以通過誘導自噬延緩組織損傷289L__ 1^24487 及促進表皮再生修復。因此,雷帕霉素在皮膚的病理289| |mT0R 學和生理學中的研究價值值得關注。]—=====^ 隨著在生命科學領域中自噬研究的不斷深入，作78Atg-7 為人類最大器官的重要構成——角質形成細胞自噬的 生物學意義得到了很多學者的關注。例如，自噬參與角15 質形成細胞分化ii7],某些藥物或生物學活性物質可以‘ 誘導角質形成細胞自噬…、然而，雷帕霉素對角質形45p_actin 成細胞自噬的誘導效應及其分子機制目前仍然缺乏研,‘,j+|)g,丨、階),~ ：.,^ 究資料。0此,我們設計并實施了本項研究。使用不同1:空白對照，2:DMSO，3:1nmol/L雷帕霉素， 、Nr^N:^山二系豐.^ A?,

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