【摘要】： 第一部分HIF-1α及其下游靶基因VEGF和GLUT-1在黑素瘤的表達 目的研究缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和葡萄糖轉(zhuǎn)運體-1(GLUT-1)在惡性黑素瘤組織和惡性黑素瘤細胞系A(chǔ)375,A875,KZ28中的表達,探討HIF-1α作為黑素瘤基因治療靶點的可能性。 方法①應用免疫組織化學方法檢測77例惡性黑素瘤組織HIF-1α、VEGF、GLUT-1的表達,分析其表達的相關(guān)性以及與臨床病理關(guān)系,并且以20例色素痣組織作為對照研究。②應用免疫組織化學方法、Western blot方法、ELISA方法對缺氧條件下培養(yǎng)的A375,A875,KZ28中HIF-1α、VEGF、GLUT-1進行檢測,并且以常氧條件下培養(yǎng)的上述細胞系作對照。 結(jié)果①在77例惡性黑素瘤組織中,65例表達HIF-1α,55例表達VEGF,53例表達GLUT-1,而在20例色素痣組織2例表達HIF-1α、4例表達VEGF、3例表達GLUT-1;②在惡性黑素瘤組織中,HIF-1α與VEGF、GLUT-1的表達呈正相關(guān);③在惡性黑素瘤組織中HIF-1α與VEGF、GLUT-1的表達與腫瘤的惡性程度相關(guān)。④HIF-1α、VEGF、GLUT-1在缺氧培養(yǎng)條件下的A375,A875,kZ28中表達明顯高于上述三株細胞系在常氧培養(yǎng)條件下的表達。⑤分泌型的VEGF和膜型表達的GLUT-1隨缺氧時間延長而增加,與HIF-1α表達正相關(guān)。 結(jié)論①HIF-1α、VEGF、GLUT-1可作為區(qū)別良、惡性黑素細胞腫瘤的重要指標;②在黑素瘤中HIF-1α的表達影響其下游基因VEGF、GLUT-1的表達③HIF-1α是黑素瘤基因治療的理想靶點。 第二部分HIF-1α-shRNAs表達載體的構(gòu)建及鑒定 目的構(gòu)建針對HIF-1α的發(fā)卡樣shRNA真核表達載體HIF-1α-shRNA,并轉(zhuǎn)染惡性黑素瘤細胞,證實其在體外培養(yǎng)惡性黑素瘤細胞中對HIF-1α的干擾作用及引起的效應。 方法①人工合成三對互補并編碼相應短發(fā)夾狀HIF-1α-shRNAs的寡核苷酸鏈,將其插入到Pgenesil-1載體中,經(jīng)酶切和測序鑒定所構(gòu)建的重組體是否正確;②采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(real time RT-PCR)、Western blot分別檢測轉(zhuǎn)染細胞HIF-1αmRNA和蛋白的表達變化。對其下游基因分泌型VEGF和膜型GLUT-1蛋白表達的變化分別采用ELISA和流式細胞儀檢測技術(shù);③在人惡性黑素瘤細胞系A(chǔ)3758中,用G418篩選沉默效果最佳的HIF-1α-shRNAs的細胞,用FCM檢測GFP的表達鑒定穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的單克隆細胞系;④上述穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系在缺氧情況下培養(yǎng),觀察其凋亡和增殖變化。 結(jié)果①經(jīng)酶切和測序證明HIF-1α-shRNAs序列正確;②三株MM細胞系中轉(zhuǎn)染HIF-1α-shRNAs載體后,shRNA1沉默效果最佳,HIF-1αmRNA和蛋白表達均較對照組明顯下降(P0.01),并在三株MM細胞系中具有平行作用,同時也可以下調(diào)VEGF和GLUT-1的表達。③熒光顯微鏡下觀察到了G418篩選穩(wěn)定表達shRNA1的A375細胞,FCM檢測GFP表達均在98%以上;④穩(wěn)定表達shRNA1的A375細胞在缺氧條件培養(yǎng)可以引起細胞凋亡和抑制細胞增殖。 結(jié)論測序結(jié)果表明發(fā)卡樣的HIF-1α-shRNA真核表達載體構(gòu)建成功,轉(zhuǎn)染A375、A875、KZ28細胞后獲得穩(wěn)定表達,并可特異性封閉HIF-1α的表達,下調(diào)VEGF和GLUT-1的表達,篩選和鑒定出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染單克隆細胞系A(chǔ)375在缺氧條件下可以引起細胞凋亡和抑制細胞增殖,為進一步研究HIF-1α-shRNA載體在惡性黑素瘤治療中的作用提供了實驗基礎(chǔ)。 第三部分靶向分子TfR在惡性炓素瘤表達 目的檢測基因治療靶向分子TfR在惡性黑素瘤組織和細胞系A(chǔ)375、A875、KZ28的表達,以明確TfR作為基因治療的靶向分子的可能性。 方法①應用免疫組織化學方法檢測77例惡性黑素瘤組織TfR的表達,并且以20例色素痣組織作為對照研究。②應用免疫組織化學方法、western blot方法、流式細胞儀檢測方法對常氧和缺氧條件下培養(yǎng)的A375,A875,KZ28中TfR表達進行檢測,并且以已知低表達TfR的卵巢癌細胞系A(chǔ)2780進行對照。③分析在體外常氧和缺氧條件下培養(yǎng)的MM細胞株中TfR表達不同的可能機制。 結(jié)果①在77例惡性黑素瘤組織中,70例表達TfR,而在色素痣組織只有5例表達;②在惡性黑素瘤組織中,TfR與腫瘤的病理分期相關(guān);③在常氧培養(yǎng)的A375,A875,KZ28中TfR的表達分別為97%,89%,79%,A2780的表達為2%;④免疫組織化學方法、western blot方法檢測惡性黑素瘤組織中TfR的表達與流式結(jié)果趨勢相同。⑤缺氧在A375細胞株中對TfR的表達呈雙相作用,早期表達減少,晚期表達增加。⑥缺氧對A375細胞株中對TfR的表達呈雙相作用可能與缺氧早期促進凋亡,晚期引起細胞增殖有關(guān)。 結(jié)論①TfR在惡性黑素瘤組織和細胞系A(chǔ)375,A875,KZ28明顯高表達,是理想的黑素瘤基因治療的靶向分子。②缺氧對黑素瘤細胞系TfR的表達呈雙相作用,對我們個體化的利用TfR作為靶向分子提供了更加合理的理論依據(jù)。 第四部分Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex對惡性黑素瘤治療靶向性實驗研究 目的研究Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex在TfR高表達的黑素瘤細胞系A(chǔ)375以及在A375荷瘤鼠的體內(nèi)模型的靶向分布,以期為下一步系統(tǒng)使用Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex治療A375荷瘤鼠提供理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。 方法①應用FCM方法檢測轉(zhuǎn)染不同實驗組的GFP的表達,以TfR低表達的A2780細胞系做對照。②應用Real time RT-PCR、western blot方法檢測Tf-PEI-HIF-1α- shRNA complex系統(tǒng)治療的A375荷瘤鼠和A2780荷瘤鼠中腫瘤組織以及重要臟器GFP的表達。 結(jié)果①在體外實驗中,A375組中,Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex轉(zhuǎn)染后GFP表達到達65%,與脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染相當,在A2780組中,Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex轉(zhuǎn)染后均在5%以下。②在體內(nèi)實驗中,Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex系統(tǒng)治療的A375荷瘤鼠的腫瘤組織較重要臟器肝、脾、心、腎GFP的mRNA及蛋白質(zhì)具有明顯差異(P0.01),在對照組A2780荷瘤鼠中腫瘤組織與重要臟器肝、脾、心、腎GFP的mRNA及蛋白質(zhì)沒有明顯表達差異(P0.05)。 結(jié)論①Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex靶向治療在TfR高表達的黑素瘤細胞系A(chǔ)375有特異性靶向分布,并且轉(zhuǎn)染效率高。②在TfR高表達的黑素瘤細胞系A(chǔ)375荷瘤鼠中,Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex系統(tǒng)靶向治療具有腫瘤靶向特異性,為黑素瘤基因治療研究提供了實驗依據(jù)。 第五部分Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex對惡性黑素瘤荷瘤鼠生物學行為影響的實驗研究 目的觀察Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex系統(tǒng)治療對A375荷瘤鼠的生長抑制及可能的機制進行探討。 方法①分別對接受Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex系統(tǒng)治療的A375、A2780荷瘤鼠腫瘤大小進行測量,按公式(L×W2)/2計算腫瘤體積大小。②治療結(jié)束后處死荷瘤鼠,采用免疫組化和western blot方法檢測HIF-1α、VEGF、GLUT1的表達情況。③治療結(jié)束后處死荷瘤鼠,采用免疫組化方法檢測MVD;酶顯色法檢測腫瘤組織糖酵解產(chǎn)物乳酸含量。末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標記法(TUNEL)定量檢測兩組裸鼠模型的腫瘤組織凋亡; 結(jié)果①體內(nèi)實驗證明,實驗組腫瘤生長速度也明顯減慢(P0.01)②實驗組HIF-1α、VEGF、GLUT1表達明顯低于對照組(P0.01)③實驗組和對照組MVD無顯著性差異(P0.05)。④實驗組腫瘤組織勻漿的乳酸含量明顯低于對照組(P0.01)。⑤實驗組可見大量凋亡細胞,對照組僅見少許凋亡細胞,實驗組凋亡指數(shù)與對照組相比有顯著性差異(P0.01)。 結(jié)論①通過Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex靶向RNA干擾技術(shù)不但能阻斷HIF-1α的表達,還能沉默其下游靶基因VEGF、GLUT1的表達,從而在體內(nèi)可顯著性抑制惡性黑素瘤生長,為惡性黑素瘤基因治療研究提供了實驗依據(jù)。②Tf-PEI-HIF-1α-shRNA complex抑制惡性黑素瘤生長,可能與抑制糖酵解,促進腫瘤組織凋亡有關(guān),未發(fā)現(xiàn)與抑制腫瘤血管生成有關(guān)。
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R739.5
【圖文】：

34圖 1 惡性黑素瘤和色素痣的臨床圖片和皮膚病理圖片圖 1A：交界痣圖 1B：肢端惡性黑素瘤圖 1C：交界痣的皮膚病理 HE 染色×40圖 1D：肢端惡性黑素瘤皮膚病理 HE 染色×40

35IF-1α、VEGF 和 GLUT-1 在黑素瘤和色素痣免疫組化的表達（ 2A：HIF-1α 在黑素瘤的表達； 圖 2B：HIF-1α 在色素痣的表達； 2C：VEGF 在黑素瘤的表達； 圖 2D：VEGF 在色素痣的表達； 2E：GLUT-1 在黑素瘤的表達； 圖 2F：GLUT-1 在色素痣的表達；

【共引文獻】

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2 ;Increased pretreatment levels of serum LDH and ALP as poor prognostic factors for nasopharyngeal carcinoma[J];癌癥;2012年04期

3 ;An improved large eddy simulation of two-phase flows in a pump impeller[J];Acta Mechanica Sinica;2007年06期

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本文編號：2735632