【摘要】： 研究背景與目的 惡性黑素瘤(malignant melanoma,MM)是一種高度惡性的腫瘤,發(fā)生隱蔽,易發(fā)生血管和淋巴結轉移,發(fā)展迅速、預后差、死亡率高。刪的生長和轉移依賴于腫瘤內(nèi)的血管生成(angiogenesis),而血管內(nèi)皮生長因子(vascularendothelial growth factor,VEGF)在腫瘤血管生成機制中處于核心地位。研究表明MM血管生成十分活躍,VEGF作為最重要的促血管生成因子而逐漸成為研究熱點。 已知的大麻素受體(cannabinoid receptor CB-R)分為Ⅰ型大麻素受體(cannabinoid receptor 1,CB-R1)和Ⅱ型大麻素受體(cannabinoid receptor 2,CB-R2),均為G-蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptors,GPCRs),GPCRs在腫瘤的生長和血管生成中具有重要作用。研究表明CB-R2具有抗炎癥、抗增殖、抗腫瘤等作用,CB-R2激動劑體外試驗可誘導細胞凋亡,體內(nèi)試驗可抑制腫瘤的生長而無明顯的副反應。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),CB-R2受體在MM組織中呈高表達,但對其在刪中是否參予遷移、侵襲和血管生成的作用機制尚不完全明確。如能證實CB-R2激動劑具有抗血管生成和抑制腫瘤生長的功能,其可能成為治療MM新的抗血管生成靶點藥物。本課題的目的是通過體外和體內(nèi)實驗模型,擬證明CB-R2參與MM的發(fā)病過程,探討CB-R2受體激動劑JWH-133和WIN55,212-2在MM中的抗腫瘤活性和抗血管生成的作用與機制,為其在臨床應用提供新思路。 研究方法 1.體外實驗以人惡性黑素瘤A375細胞為研究模型 應用免疫熒光檢測CB-R2在A375細胞中的表達與定位;RT-PCR和Westernblot檢測CB-R2在A375細胞中mRNA和蛋白水平的表達;Real time PCR和免疫組化檢測CB-R2激動劑JWH-133和WIN55,212-2對A375細胞CB-R2表達的影響;MTT、劃痕實驗和Transwell小室模型檢測JWH-133和WIN55,212-2對A375細胞增殖、遷移和侵襲作用的影響;Real-time PCR、和ELISA檢測JWH-133和WIN55,212-2對A375細胞VEGF在mRNA和蛋白水平表達的影響;TUNEL檢測JWH-133和WIN55,212-2對A375細胞凋亡的影響。 2.體內(nèi)實驗以人惡性黑素瘤A375細胞裸鼠移植瘤為研究模型 建立人惡性黑素瘤裸鼠移植瘤動物模型,觀察體內(nèi)成瘤情況。應用免疫熒光檢測瘤組織中CB-R2的表達與定位;Real-time PCR、western blot和免疫組化檢測CB-R2激動劑JWH-133和win55,212-2對腫瘤組織中CB-R2和VEGF在mRNA和蛋白水平表達的影響;TUNEL檢測JWH-133和win55,212-2對腫瘤組織細胞凋亡的影響。 結果 1.人惡性黑素瘤A375細胞體外模型實驗結果 ①人惡性黑素瘤A375細胞在mRNA和蛋白水平均表達CB-R2,其表達定位于胞漿和胞膜,胞核無染色。②不同濃度JWH-133和WIN55,212-2(0.01/0.1/1/10/100umol/L)對A375細胞增殖具有抑制作用,48h達到高峰(P＜0.05);而兩種藥物對A375細胞增殖的抑制作用,經(jīng)統(tǒng)計學分析比較無明顯差異(P＞0.05)。③JWH-133和WIN55,212-2抑制A375細胞的遷移和侵襲能力;與對照組比較,1umol/L濃度JWH-133組和WIN55,212-2組細胞相對遷移面積顯著降低,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);1umol/L濃度JWH-133組和WIN55,212-2組細胞穿膜細胞數(shù)與對照組比較明顯減少,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而兩種藥物組的細胞相對遷移面積和穿膜細胞數(shù),經(jīng)統(tǒng)計學分析比較無明顯差異(P＞0.05)。④不同濃度JWH-133和win55,212-2(1umol/5umol/10umol/L)刺激A375細胞24h,48h和72h后,可降低VEGF在不同時相點mRNA和蛋白水平的表達,與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);并且這種抑制效應呈時間劑量依賴關系,JWH-133和WIN55,212-2劑量越大,刺激時間越長,VEGF表達的降低越明顯。⑤1umol/L濃度JWH-133和WIN55,212-2刺激A375細胞24h,48h和72h后,可誘導A375細胞凋亡,JWH-133組A375細胞凋亡率分別為7.22%、9.1 7%和11.45%;WIN5 5,212-2組A375細胞凋亡率分別為6.45%、8.12%和10.34%;而對照組凋亡率為6.35%、6.09%和6.39%,JWH-133組和WIN55,212-2組與對照組凋亡率比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而兩種藥物之間經(jīng)統(tǒng)計學分析比較無明顯差異(P＞0.05)。 2.人惡性黑素瘤A375細胞裸鼠移植瘤模型實驗結果 ①JWH-133和WIN55,212-2可以抑制人惡性黑素瘤裸鼠移植瘤的生長,抑瘤率分別為43.14%和39.47%。②予JWH-133和WIN55,212-2,腫瘤組織可在mRNA和蛋白水平上調(diào)CB-R2的表達,與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而兩種藥物之間經(jīng)統(tǒng)計學分析比較無明顯差異(P＞0.05)。③JWH-133和WIN55,212-2在mRNA和蛋白水平降低腫瘤組織中VEGF的表達;與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);兩種藥物之間經(jīng)統(tǒng)計學分析比較無明顯差異(P＞0.05)。④JWH-133和WIN55,212-2可誘導腫瘤組織中腫瘤細胞凋亡,對照組、JWH-133組和WIN55,212-2組腫瘤組織凋亡率分別為7.33%、12.84%和11.57%。JWH-133組和WIN55,212-2組與對照組凋亡率比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);而兩種藥物之間經(jīng)統(tǒng)計學分析比較無明顯差異(P＞0.05)。 結論 1.大麻素Ⅱ型受體CB-R2參與了MM的發(fā)病過程; 2.JWH-133和WIN55,212-2可以抑制A375細胞增殖、遷移和侵襲的能力; 3.體外和體內(nèi)實驗模型中,JWH-133和WIN55,212-2可誘導MM腫瘤細胞凋亡: 4.體外和體內(nèi)實驗模型中,JWH-133和WIN55,212-2可降低MM腫瘤細胞和組織VEGF的表達和分泌,抑制血管生成,控制腫瘤的生長; 5.JWH-133和WIN55,212-2在抑制惡性黑素瘤細胞增殖、遷移、侵襲能力以及促進細胞凋亡等作用機制方面,二者無顯著差異。
【學位授予單位】：中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R739.5
【圖文】：

!均數(shù)比較采用幣復討，舉資料的方井分結果A375和HaCat細胞中的表達375和HaCat細胞中耐詡A水平的表達CR擴增A3了5和}1a(二zlt細胞總尺NA逆轉產(chǎn)物為522bp的明殼條們扛結果{.辦J、八達CB一RZ(見圖l)、P

212一2組比較，差異具有統(tǒng)計學意義(只0.05)。HaCat細胞對照組各時間點細胞相對遷徙面積與藥物刺激組比較變化不明顯，差異無統(tǒng)計學意義(乃0.05)(見表2、表3和圖10一11)。2.，」，H一133和WIN55，212一2對A375和HaCat細胞侵襲能力的影響Matrigel在聚碳酸濾膜表面重建可形成類似天然基底膜結構，細胞穿過Matrigel的能力反映細胞穿過基底膜能力，即細胞侵襲能力。對照組A375細胞穿過Matrigel細胞數(shù)較多，lumol/L濃度JwH一133和WIN55，212一2處理組A375細胞穿過Matrigel細胞數(shù)較少，與對照組比較差異具有統(tǒng)計學意義(只0.05)(見表4圖12)。表 2A375細胞相對遷移面積值比較(藥物濃度lum01/L)(x士s) 6roupIOD一F尸n二呂0h2魂 h48hC()NJ陽一1331660魂11:玉士29327.722936:38 11736213士 163呂 5.051872:考6.50土36895.93 155242.13士:考0161.:弓225士 216盛性.魂400士19797.7通:考 1.:30.0001Wl、55

【共引文獻】

相關博士學位論文 前2條

1 張友才;微衛(wèi)星不穩(wěn)定性大腸腺癌腫瘤抑制基因CpG島甲基化研究[D];武漢大學;2004年

2 王_";肝細胞肝癌和肺癌中乙酰膽堿自泌系統(tǒng)的研究[D];復旦大學;2007年

相關碩士學位論文 前1條

1 趙梓綱;CB2受體在皮膚惡性腫瘤的表達及其意義[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學院;2008年

本文編號：2719298