【摘要】： 皮膚惡性黑素瘤起源于黑素細胞,致死率高,轉(zhuǎn)移后無有效療法。miRNAs是一類新發(fā)現(xiàn)的在腫瘤中發(fā)揮癌基因或抑癌基因樣作用的小分子RNA。本課題研究miRNA-let-7a在皮膚黑素瘤發(fā)病機制中的作用,尋找皮膚黑素瘤新的早期診斷標記和治療靶點。 目的研究miRNA-let-7a在福爾馬林固定石蠟包埋(FFPE)的皮膚黑素瘤組織和黑素瘤細胞系A(chǔ)375中的表達,探討1niRNA-let-7a對黑素瘤細胞系A(chǔ)375細胞增殖和凋亡的影響及其作用機制；研究BRAF蛋白在黑素瘤細胞系A(chǔ)375和原代黑素細胞的表達差異,探索miRNA-let-7a對黑素瘤發(fā)病中關(guān)鍵蛋白BRAF的作用。 方法 選取福爾馬林固定石蠟包埋的黑素瘤組織13例,先天性色素痣組織10例,培養(yǎng)黑素瘤細胞系A(chǔ)375和原代黑素細胞,分別采用High Pure miRNA Isolation試劑盒和RNAiso Plus抽提miRNA及總RNA,逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,用Taqman MGB探針和相應(yīng)的引物,在ABI Prism 7500熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量PCR。對SDS軟件生成的數(shù)值進行計算和統(tǒng)計學分析。 蛋白質(zhì)印跡法檢測BRAF蛋白在黑素瘤細胞系A(chǔ)375及原代黑素細胞的表達差異。 應(yīng)用cy3標記的siRNA轉(zhuǎn)染A375細胞,熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率。利用hsa-let-7a的模擬物及其陰性對照分別瞬時轉(zhuǎn)染黑素瘤細胞系A(chǔ)375,CCK-8實驗計算轉(zhuǎn)染后兩組細胞增殖的差異,流式細胞術(shù)檢測兩組細胞凋亡的不同,免疫印跡實驗分析兩組細胞Caspase-3((半胱天冬酶-3)蛋白和BRAF蛋白的表達差異。 結(jié)果從福爾馬林固定石蠟包埋的組織中成功抽提出miRNA,實時熒光定量PCR結(jié)果顯示miRNA-let-7a在FFPE黑素瘤組織中的表達明顯低于色素痣組織(P0.05),在黑素瘤細胞系A(chǔ)375中的表達明顯低于原代黑素細胞。熒光顯微鏡下觀察可見siRNA的轉(zhuǎn)染效率約80-90%。與陰性對照相比,50nM的hsa-let-7a模擬物轉(zhuǎn)染A375細胞后,1niRNA-let-7a的表達升高2.067倍。采用miRNA-let-7a的模擬物轉(zhuǎn)染后,與陰性對照相比,A375細胞增殖受抑,細胞凋亡增加(P0.05)。與黑素細胞相比,BRAF蛋白在黑素瘤A375細胞系表達升高；與陰性對照相比,miRNA let-7a的模擬物轉(zhuǎn)染A375細胞系后,caspase-3蛋白和BRAF蛋白表達均下降。 結(jié)論FFPE組織適合用來研究miRNA在黑素瘤中的表達,miRNA-let-7a在黑素瘤中表達下調(diào),過表達miRNA-let-7a可抑制黑素瘤細胞系A(chǔ)375細胞的增殖并促進其凋亡,促進凋亡的機制可能與miRNA-let-7a下調(diào)caspase-3有關(guān)。黑素瘤發(fā)病中的關(guān)鍵蛋白BRAF在黑素瘤細胞系A(chǔ)375中的表達明顯高于原代黑素細胞,miRNA-let-7a可下調(diào)BRAF蛋白的表達。總之,miRNA-let-7a可能在黑素瘤的發(fā)病中發(fā)揮抑癌基因的作用,有望成為黑素瘤早期診斷指標和治療靶點。
【學位授予單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R739.5
【圖文】：

圖1miRNA與癌癥關(guān)聯(lián)圖a正常組織中miRNA下調(diào)相應(yīng)的靶基因的表達發(fā)揮生物學作用bm1RNA的靶基因是原癌基因，發(fā)揮腫瘤抑制基因樣作用cmiRNA的靶基因是抑癌基因，發(fā)揮癌基因樣作用。巨前己發(fā)現(xiàn)數(shù)種miRNA在黑素瘤細胞表達異常，其中miRNA一221和miRNA一222在黑素瘤中表達升高，可以通過下調(diào)p27KIPI/CDKNIB和c一心T受體兩條通路來促進黑素細胞的惡性轉(zhuǎn)化，在黑素瘤中發(fā)揮癌基因樣作用卜61。而miRNA一137、一34a、一199a和let一7家族成員let一7a、let一7b等，分別下調(diào)相應(yīng)的靶基因，在黑素瘤中發(fā)揮抑癌基因樣的作用卜12]。國內(nèi)僅王眾等研究了miRNA一21在黑素瘤細胞系的表達及其對黑素瘤細胞系活性的影響l’31。miRNA對黑素瘤相關(guān)基因的表達調(diào)控研究，不僅指向早期黑素瘤發(fā)生的新的調(diào)節(jié)機制，而且為將來靶向治療開辟了道路。鑒于miRNA的特性，通過調(diào)節(jié)其表達控制腫瘤的生物學行為是目前治療腫瘤

由于miRNA分子量很小，本實驗的試劑盒中含有一個帶莖環(huán)的引物，這樣逆轉(zhuǎn)錄后cDNA的鏈變長，以利后續(xù)的定量PCR實驗(見圖2)。m唇RNA RTPrimer SSStePI:::SSStem·IooPRTTT右DNA TaqManPro加圖2采用 TaqManMGB探針法的而RNA的實時熒光定量PCR實驗包括兩部，莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄和實時熒光定量PCR

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳宏翔;李碧芳;吳艷;劉厚君;李家文;涂亞庭;;皮膚惡性黑素瘤預后因素的多元回歸分析[J];華中醫(yī)學雜志;2008年01期

2 ;Brain metastases of malignant melanoma in Chinese:report of 23 cases[J];Chinese Medical Journal;2007年12期

本文編號：2714345