發(fā)布時間：2020-06-11 15:02

【摘要】：銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，其病因復雜，各種內外因素共同參與其發(fā)病機制。銀屑病患者具有明顯的免疫學異常，多種細胞因子作為主要的效應分子參與銀屑病的病理過程。 IL-8是銀屑病患者體內一種主要的異常表達的細胞因子。角質形成細胞、單核細胞、巨噬細胞和血管內皮細胞等是銀屑病患者體內主要的IL-8來源，而IL-8受體則廣泛地分布于銀屑病患者的角質形成細胞、中性粒細胞、T細胞和肥大細胞。在銀屑病的病理過程中，IL-8既作為啟動分子趨化中性粒細胞、淋巴細胞等向皮膚移行和浸潤，促進其他細胞因子的分泌，又作為效應分子直接刺激角質形成細胞增殖，并促進真皮淺層血管的增生。因此通過抗體阻斷IL-8與受體之間的作用有可能對銀屑病具有治療效果。 噬菌體抗體庫技術通過將全套抗體基因展示在噬菌體表面，為此便可以方便地利用不同抗原篩選相應的抗體，這不僅是一種制備人源性抗體的有效方法，而且大容量、具有良好多樣性的抗體庫，對獲得高親和力的抗體以及在對抗體性能進行改造方面具有較強的優(yōu)勢。噬菌體抗體庫技術已經(jīng)成為抗體工程領域的關鍵技術之一。以噬菌體抗體庫技術為 第四軍醫(yī)大學碩士學位論文 技術平臺制備人源性抗IL一8抗體有可能為銀屑病的治療帶來新的希望。 IL一8一His融合蛋白原核表達載體PRSET-IL一8經(jīng)常規(guī)氯化鈣法轉化 BLZI(DE3)大腸桿菌感受態(tài)細胞，挑單克隆于LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)。待細菌 生長至半對數(shù)期時加入IPTG誘導蛋白表達。細菌沉淀經(jīng)超聲裂菌后過 0.45 pm濾膜，取上清對PBS透析過夜。透析后的上清以His抗體免疫親 和層析柱純化，純化后的蛋白經(jīng)PBS透析后以SDS一PAGE電泳鑒定純化 效果。結果表明，在30℃低溫誘導表達的情況下，IL一8一His融合蛋白在 大腸桿菌中以可溶形式表達于細菌周質腔中，，經(jīng)SDS一PAGE電泳鑒定表 明，純化后的蛋白在分子量約11 000大小處呈單一條帶。經(jīng)分光光度計 粗定量測得IL一8一His融合蛋白的濃度約為1.59幾。 純化后的IL一8一HIS融合蛋白以包被緩沖液稀釋后固相化至抗原管， 以BSA/PBS封閉后加入噬菌體抗體庫孵育，用含O，05%吐溫的PBS洗滌 后加入半對數(shù)生長期的XL-Blue細菌。感染巧min后取適量鋪于含氨節(jié) 青霉素的LB平板測定滴度，其余菌液擴大培養(yǎng)。在氨節(jié)青霉素和卡那霉 素的壓力選擇下，加入輔助噬菌體VCSM誘導噬菌體抗體擴增。次日濃 縮噬菌體抗體即次級庫，用于下一輪篩選。共進行3輪篩選，每輪篩選 均測定次級庫的滴度，并計算噬菌體抗體的投入產(chǎn)出比(回收率)作為特異 性噬菌體抗體富集的指標。在第3輪篩選后，從含氨節(jié)青霉素的 LB平板 上挑單克隆于SB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，于半對數(shù)生長期加入輔助噬菌體 VCSM誘導噬菌體抗體表達，離心收集上清即為噬菌體抗體上清。以 lL一8一His融合蛋白包被ELISA板，依次加入待測噬菌體抗體上清及H即- 羊抗M13抗體，最后以OPD底物顯色。顯色陽性的克隆再以IL一8一His 融合蛋白、人IgG、表皮角蛋白、BSA和His蛋白為抗原分別包被ELIsA 板，鑒定抗原、抗體反應的特異性。經(jīng)過3輪篩選，噬菌體抗體的回收 率得到約300倍的富集。最后一輪篩選后挑取的60個單菌落制備噬菌體 抗體，經(jīng)ELISA檢測第2株和第23株克隆與IL一8一His融合蛋白具有結合 第四軍醫(yī)大學碩士學位論文 活性，而與人IgG、表皮角蛋白等無關蛋白均無結合活性，表明所獲得的 噬菌體抗體具有較高的特異性。測序結果表明，克隆2和克隆23的VH 基因均屬于人免疫球蛋白VH3亞群，V入基因則分別屬于V入DPLS和 V入DPLZ亞群。 IL一8作為與銀屑病密切相關的細胞因子，被認為是治療銀屑病的靶 點之一，然而目前的臨床資料卻顯示了兩種抗IL一8抗體迥然不同的治療 效果，因此抗IL一8抗體對銀屑病的治療作用尚無法評價。改變抗IL一8抗 體的應用方式，開發(fā)穿透性更強的小分子抗體、特異性更強的抗IL一8/抗 角蛋白雙特異性抗體，對抗體進行人源化和提高抗體的親和力等有可能 提高抗IL一8抗體治療銀屑病的療效。本研究通過噬菌體抗體庫技術制備 了抗IL一8單鏈抗體，有望通過直接應用或進一步構建抗IL一8/抗角蛋白雙 特異性雙鏈抗體，從而達到治療銀屑病的目的。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2004
【分類號】：R758.63

【參考文獻】

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3 王妍,張興義;幾種柱層析的特點和在純化工藝中的選擇[J];中國生物制品學雜志;1999年03期

本文編號：2708076