本文關(guān)鍵詞：RNA干擾技術(shù)對(duì)犬小孢子菌PQ-LRP基因沉默的研究及面部線狀紅斑狼瘡1例，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的： 在本課題組前期采用cDNA快速末端擴(kuò)增法（RACE）得到膜蛋白PQ-LRP基因全長(zhǎng)序列后，本實(shí)驗(yàn)擬構(gòu)建犬小孢子菌PQ-LRP基因RNA干擾載體，探究RNA干擾載體對(duì)犬小孢子菌PQ-LRP基因表達(dá)的影響，構(gòu)建PQ-LRP基因RNA干擾株，為后期探討此基因在發(fā)病機(jī)制中的作用提供理論基礎(chǔ)及新型藥物的開(kāi)發(fā)提供設(shè)計(jì)靶位。 方法： 1、提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為PCR模板，，用引物L(fēng)RP-F和LRP-R擴(kuò)增LRP基因的干擾序列，來(lái)得到長(zhǎng)度為600bp的正向干擾片段，連接到PUC-PUT載體的Ptrpc啟動(dòng)子和間隔序列之間，擬得到中間載體PUC-PLUT；再次用引物L(fēng)RP-F和LRP-R擴(kuò)增LRP基因的干擾序列，來(lái)得到長(zhǎng)度600bp的反向干擾序列連接到PUC-PLUT載體的間隔序列和Ttrpc終止子之間，擬得到中間載體PUC-PLULT，與PCB309進(jìn)行連接，最終構(gòu)建出干擾載體PCB309-PLULT。 2、根據(jù)潮霉素不同濃度對(duì)照法，確定篩選犬小孢子菌轉(zhuǎn)化子的潮霉素最佳濃度。 3、采用電擊法將含有干擾載體PCB309-PLULT的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入根癌農(nóng)桿菌中，利用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系對(duì)犬小孢子PQ-LRP基因進(jìn)行沉默。 4、應(yīng)用Real Time PCR方法檢測(cè)PCB309-PLULT載體對(duì)犬小孢子菌PQ-LRP基因表達(dá)的干擾作用。 結(jié)果： 構(gòu)建了中間載體PUC-PLUT、PUC-PLULT，并通過(guò)PCR、基因測(cè)序進(jìn)行鑒定；成功構(gòu)建了長(zhǎng)為8825bp的干擾載體PCB309-PLULT，并通過(guò)酶切測(cè)定為該目的載體；篩選出犬小孢子菌轉(zhuǎn)化子的潮霉素最佳濃度為300μg/ml；用實(shí)時(shí)定量PCR方法對(duì)犬小孢子菌干擾前后進(jìn)行鑒定：以干擾前PQ-LRP相對(duì)表達(dá)量1.0為標(biāo)準(zhǔn)，干擾后PQ-LRP相對(duì)表達(dá)量為0.39，干擾后下調(diào)61%。 結(jié)論： 成功構(gòu)建的干擾載體PCB309-PLULT可以明顯抑制犬小孢子菌PQ-LRP基因的表達(dá)，并成功構(gòu)建了PQ-LRP基因干擾株，為研究膜蛋白PQ-LRP基因在犬小孢子菌致病中的功能奠定基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：RNA干擾 犬小孢子菌 PQ-LRP基因
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R758.62
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 第一部分 RNA 干擾技術(shù)對(duì)犬小孢子菌 PQ-LRP 基因沉默的研究11-30
• 前言11
• 材料與方法11-20
• 1.實(shí)驗(yàn)材料11-13
• 2.實(shí)驗(yàn)方法13-20
• 2.1 質(zhì)粒提取、DNA 純化回收13
• 2.2 總 RNA 提取13-14
• 2.3 RNA 反轉(zhuǎn)錄14-15
• 2.4 感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化15
• 2.5 RNA 干擾載體 pCB309-PLULT 的構(gòu)建15-17
• 2.6 電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備及轉(zhuǎn)化17-18
• 2.7 確定潮霉素的篩選濃度、制備轉(zhuǎn)化子并進(jìn)行基因定量分析18-20
• 結(jié)果20-24
• 1. 犬小孢子菌的鑒定20
• 2. RNA 提取20
• 3. RNA 干擾載體 pCB309-PLULT 的構(gòu)建20-21
• 4．PCB309-PLULT 質(zhì)粒的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化21
• 5. PUC-PLUT 的測(cè)序21-23
• 6．確定犬小孢子菌對(duì)潮霉素的最佳轉(zhuǎn)化濃度23
• 7.應(yīng)用 Real Time PCR 方法分析相對(duì)表達(dá)量23-24
• 討論24-27
• 結(jié)論27-28
• 參考文獻(xiàn)28-30
• 第二部分 面部線狀皮膚型紅斑狼瘡 1 例30-32
• 材料30-31
• 討論31
• 參考文獻(xiàn)31-32
• 綜述32-39
• 參考文獻(xiàn)37-39
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文情況39-40
• 致謝40-41

【參考文獻(xiàn)】

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8 余進(jìn),萬(wàn)U

本文編號(hào)：270215