【摘要】： 沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,C.t)是引起生殖道衣原體感染(Genitalchlamydial infection)的主要病原體占40%～50%。沙眼衣原體感染目前已是西方國家最常見的性傳播疾病之一,發(fā)病人數(shù)增加很快,已超過淋病。在我國,沙眼衣原體感染的患病人數(shù)也在迅速增加。感染者可以有癥狀或無癥狀,因此診斷常很困難。沙眼衣原體感染可引起男性前列腺炎、附睪炎、直腸炎、女性盆腔炎、不孕癥、異位妊娠等并發(fā)癥,造成嚴(yán)重的后果。同時(shí)由于治療抗生素選擇不當(dāng)、用量小、時(shí)間短等濫用抗生素日趨嚴(yán)重使沙眼衣原體耐藥性問題突出,加大了治療的困難。因此,近些年來國內(nèi)外研究學(xué)者擴(kuò)大了對沙眼衣原體研究的廣度和深度。其中,針對衣原體噬菌體的研究得到關(guān)注,噬菌體噬菌體(Phage)是一種感染細(xì)菌的病毒,它能使所寄生的細(xì)菌病變并解體,可被廣泛地用于阻擋和治療感染,在抗生素耐藥日趨嚴(yán)重的情況下,噬菌體抗感染的研究受到了廣泛重視。本課題旨在通過對衣原體GPIC噬菌體衣殼蛋白Vp1的表達(dá)、鑒定、提純,獲得Vp1蛋白,同時(shí)收集206例沙眼衣原體感染者的血清篩檢出Vp1抗體。明確衣原體感染者衣原體噬菌體的存在,對于沙眼衣原體感染所致的生殖道衣原體感染的治療預(yù)防等多方面的研究有重要價(jià)值。 目的:通過實(shí)驗(yàn)研究,獲得衣原體噬菌體φCPG1的衣殼蛋白Vp1蛋白。收集沙眼衣原體感染者的血清,以便篩選出衣原體噬菌體Vp1蛋白的抗體,明確噬菌體的存在。促進(jìn)對沙眼衣原體與噬菌體的進(jìn)一步研究。 方法:挑取帶有原核表達(dá)質(zhì)粒Vp1-pET-30a(+)重組質(zhì)粒菌接種于LB液態(tài)培養(yǎng)基中進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),部分純化,離心收集不溶蛋白。按蛋白提純試劑盒說明進(jìn)行純化,通過聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定純化后的Vp1蛋白。應(yīng)用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行定量分析推算Vp1蛋白濃度。將復(fù)性后的Vp1蛋白免疫小鼠3次后內(nèi)眥靜脈取血收集血清,檢測免疫后鼠血清Vp1抗體。ELISA篩選含Vp1抗體的血清:包被Vp1蛋白于96孔酶聯(lián)板條中4℃過夜,PBST洗滌,用含3%BSA的封閉,對84例正常人和206份C.t感染者血清樣本分別進(jìn)行ELISA測定OD_(405),比較二者的檢測結(jié)果。應(yīng)用Western blot將純化的Vpl蛋白轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜上,3%奶粉-TBST液封閉,將免疫小鼠血清、未感染C.t者血清、ELISA陽性結(jié)果的血清都以用1%奶粉-TBST稀釋為1:500孵育過夜,TBST清洗,加入堿性磷酸酶標(biāo)記的羊抗人的IgG抗體1:10000孵育,BCIP/NBT顯色后即用水終止反應(yīng),觀察顏色變化鑒定Vp1抗體。 結(jié)果:帶有原核表達(dá)質(zhì)粒Vp1-pET-30a(+)重組質(zhì)粒菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),收集沉淀蛋白。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳觀察在62000處有一比其他雜帶都寬大的條帶,此為Vp1蛋白。提純蛋白后獲得目的條帶,既為純化后的Vp1蛋白。透析復(fù)性提純的目的蛋白,使Vp1蛋白具有抗原性。使用考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量,可得到推算的蛋白濃度,用以免疫小鼠和ELISA測定。純化后的Vp1蛋白以10/ml包被孔板,將免疫小鼠血清、正常人類血清分別以不同稀釋度進(jìn)行孵育,發(fā)現(xiàn)在1:400稀釋度下陽性血清OD_(405)/陰性血清OD_(405)=2.5496,比值差別最大,既此滴度下陰陽性血清較差的可能性最小。最終確定以1:400為最適血清稀釋度。待測血清樣品OD_(405)≥0.102判為陽性,反之判為陰性。按此標(biāo)準(zhǔn),測定206個(gè)臨床判定為C.t感染者血清OD_(405),共有18人判為陽性,考慮其血清中可能具有Vp1抗體。使用Western對18例ELISA陽性者血清中vp1蛋白的抗體進(jìn)行明確鑒定,發(fā)現(xiàn)4例血清具有Vp1抗體,從而發(fā)現(xiàn)C.t感染者血清中Vp1抗體的存在。 結(jié)論:1.實(shí)現(xiàn)了沙眼衣原體GPIC噬菌體φCPG1的衣殼蛋白Vp1的表達(dá)、鑒定、提純。2.測得純化后的Vp1蛋白濃度,免疫小鼠檢測免疫原性。3.通過ELISA法篩選出18例泌尿生殖道C.t感染者血清顯示Vp1蛋白的抗體。4.進(jìn)行Western blot鑒定其中4例具有vp1蛋白特異性抗體,探索沙眼衣原體患者血清中存在衣原體噬菌體的可能性。
【圖文】：

菌液超聲前后比較

結(jié)果一目的蛋白誘導(dǎo)、表達(dá)1.重組前后不同菌落在LB培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)(見圖1一1)。帶有Vpl一pET-3Oa(+)重組質(zhì)粒菌BLZI可以在含有卡那霉素的平板較好的生長，只帶有pET-3Oa(+)的空質(zhì)粒菌BLZI在含有卡那霉素的平板也有菌落生長，不含質(zhì)粒的BLZI可以在不含有卡那霉素的平板生長。[l]圖 Vp123為帶Vpl一pET-30a(+)重組質(zhì)粒菌BLZI在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)[2]圖LA4為只帶有pET-30a(+)的空質(zhì)粒菌BLZI在含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)[3」圖BLZI為不含質(zhì)粒的BLZI在不含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基上的生長狀態(tài)。圖1:重組質(zhì)粒的抗菌素平板篩選2.菌液誘導(dǎo)表達(dá)后分別經(jīng)49%振幅超聲65間隔105共12次、20%的振幅超聲105間隔105共2次超聲碎菌，，渾濁的菌液變得澄清。左試管為超聲前菌液;右試管為超聲后的菌較前更為清亮。圖2:菌液超聲前后比較二.重組子誘導(dǎo)產(chǎn)物SDS一隊(duì)GE電泳結(jié)果
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號】：R759

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2650461