【摘要】：背景:大皰性類天皰瘡(BP)是皮膚科常見的一種自身免疫性水皰病,病理特點(diǎn)為表皮下水皰,皮損有嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)和基底膜帶自身抗體和補(bǔ)體的沉積。自身反應(yīng)性B細(xì)胞活化后產(chǎn)生針對(duì)真表皮基底膜帶半橋�？乖�(BP180和BP230)的致病性自身抗體是BP發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前認(rèn)為在體液免疫中,自身抗體的產(chǎn)生依賴于B細(xì)胞受到抗原刺激后,在輔助性T細(xì)胞(Th)的輔助下發(fā)生活化、增殖,進(jìn)而分化為漿細(xì)胞,從而合成多種免疫球蛋白(Ig)。在自身抗體產(chǎn)生的過(guò)程中,一方面B細(xì)胞表面受體(BCR)捕獲抗原為B細(xì)胞活化提供了第一信號(hào),另一方面Th細(xì)胞與B細(xì)胞的相互作用為B細(xì)胞的活化提供了必不可少的第二信號(hào)。與此同時(shí),B細(xì)胞膜表面存在協(xié)同刺激分子,共同參與調(diào)控B細(xì)胞的活化。因此,探究影響B(tài)細(xì)胞活化的協(xié)同刺激分子,有助于深入解析B細(xì)胞活化和抗體生成的關(guān)鍵環(huán)節(jié),對(duì)闡明BP發(fā)病機(jī)制并探討新的治療策略具有重要意義。CD100(Semaphorin 4D)屬于信號(hào)素(Semaphorin)家族成員之一,是首個(gè)被發(fā)現(xiàn)具有免疫調(diào)節(jié)功能的信號(hào)素蛋白,為I型膜分子。CD100分子是一種細(xì)胞膜表面蛋白,全長(zhǎng)150-kDa,可被多種蛋白水解酶剪切后從細(xì)胞膜表面脫落,形成120-kDa的游離型分子(sCD100),并且這種游離形式的CD100具有和膜型CD100同樣的生物活性。CD100的受體包括CD72,Plexin-B1和Plexin-B2,其中CD72主要表達(dá)于B淋巴細(xì)胞表面。研究表明CD72是B淋巴細(xì)胞表面重要的負(fù)向協(xié)同刺激分子之一,可通過(guò)負(fù)向調(diào)控BCR信號(hào)抑制B淋巴細(xì)胞的活化和增殖。CD100與B細(xì)胞表面的CD72結(jié)合可“關(guān)閉”CD72對(duì)BCR的抑制信號(hào),參與B細(xì)胞活化、增殖、分化和成熟。因此我們提出如下假說(shuō):BP患者血清及皰液中的sCD100可以通過(guò)作用于B細(xì)胞表面的負(fù)向協(xié)同刺激分子CD72,促進(jìn)B細(xì)胞的活化、增殖和分化,進(jìn)而促進(jìn)致病性自身抗體產(chǎn)生,參與BP的發(fā)生與發(fā)展。目的:1.分析BP患者血清、皰液及局部皮損中CD100的表達(dá)情況,明確CD100與BP的相關(guān)性;2.明確CD100對(duì)BP患者致病性自身抗體產(chǎn)生的作用,并闡明其具體機(jī)制。方法:1.收集BP患者血清、皰液和皮損組織,利用ELISA、Western blot、免疫組化及組織免疫熒光技術(shù)檢測(cè)CD100在BP患者血清、皰液及局部皮損中的表達(dá)情況。2.評(píng)估BP患者BPDAI評(píng)分,測(cè)定BP患者抗BP180及抗BP230的抗體滴度,作為反映患者病情活動(dòng)性和嚴(yán)重程度的臨床依據(jù),進(jìn)而與BP患者血清和皰液中的sCD100的濃度進(jìn)行病情相關(guān)性分析。3.用不同濃度CD100重組蛋白刺激BP患者PBMC,于不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)收集刺激后細(xì)胞培養(yǎng)上清,ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清抗BP180抗體滴度,篩選CD100重組蛋白刺激PBMC產(chǎn)生抗體的最佳濃度及刺激時(shí)間;在此基礎(chǔ)上,用CD100重組蛋白最佳濃度刺激BP患者PBMC,于最佳刺激時(shí)間ELISA檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清抗BP180及抗體BP230抗體滴度,明確CD100對(duì)BP患者致病性自身抗體產(chǎn)生的作用。4.用CD100重組蛋白刺激BP患者PBMC,離心收集細(xì)胞沉淀,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD100刺激前后B細(xì)胞的分化情況;胞內(nèi)細(xì)胞因子染色及流式細(xì)胞術(shù)篩選CD100刺激PBMC活化的下游通路;小分子通路抑制劑驗(yàn)證CD100活化B細(xì)胞的下游通路。5.收集BP患者PBMC、粒細(xì)胞、皰液細(xì)胞,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同細(xì)胞亞群膜表面CD100表達(dá)情況,明確BP患者游離型sCD100的細(xì)胞來(lái)源;使用不同蛋白水解酶處理粒細(xì)胞,明確剪切細(xì)胞膜表面CD100的蛋白水解酶,并使用蛋白水解酶特異性抑制劑驗(yàn)證其剪切功能。結(jié)果:1.BP患者血清和皰液中的sCD100水平較健康對(duì)照組顯著升高,并與BP患者的疾病嚴(yán)重程度及活動(dòng)性呈正相關(guān);免疫組化、組織免疫熒光結(jié)果顯示,BP患者表皮下水皰及真皮淺層血管周圍有大量表達(dá)CD100嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎細(xì)胞浸潤(rùn)。2.CD100重組蛋白可誘導(dǎo)BP180~+BP230~-的患者PBMC產(chǎn)生抗BP180抗體,誘導(dǎo)BP180~+BP230~+的患者PBMC產(chǎn)生抗BP180和BP230抗體,而CD100抗體可顯著抑制CD100蛋白刺激PBMC產(chǎn)生致病性自身抗體。3.CD100重組蛋白通過(guò)Akt/NF-κB/Erk通路活化PBMC產(chǎn)生致病性自身抗體,Akt/NF-κB/Erk的小分子抑制劑可顯著抑制CD100重組蛋白刺激PBMC產(chǎn)生致病性自身抗體。4.CD100重組蛋白可刺激PBMC中CD19~+CD138~-B細(xì)胞向CD19~+CD138~+漿母細(xì)胞分化。5.BP患者血清及皰液中高水平sCD100來(lái)源于ADAM10蛋白水解酶對(duì)CD15~+粒細(xì)胞膜表面CD100的剪切。結(jié)論:在BP發(fā)病過(guò)程中,ADAM10剪切BP患者CD15~+細(xì)胞表面CD100,是BP患者血清和皰液中高水平sCD100的重要來(lái)源。升高的sCD100通過(guò)與B細(xì)胞表面CD72結(jié)合,活化Akt/NF-κB/Erk信號(hào)通路,誘導(dǎo)CD19~+CD138~-初始B細(xì)胞向具備抗體分泌功能的CD19~+CD138~+漿母細(xì)胞分化,導(dǎo)致抗BP180及抗BP230抗體的產(chǎn)生,進(jìn)而引發(fā)皮膚免疫損傷。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)BP患者血清及皰液中存在高水平的sCD100,并且明確了sCD100來(lái)源于ADAM10對(duì)CD15~+粒細(xì)胞的剪切作用,證實(shí)了CD100參與BP致病性自身抗體的產(chǎn)生。研究結(jié)果豐富了BP致病性自身抗體產(chǎn)生的免疫學(xué)機(jī)制,為探索BP新的治療策略提供理論基礎(chǔ)。
【圖文】：

類天皰瘡概述性類天皰瘡(BP)是一種常見的自身免疫性大皰性皮膚病，Lever BP 是一種不同于天皰瘡和皰疹樣皮炎的獨(dú)立性疾病[1]。BP 好統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示每年新發(fā)病例約為 2.4-42.8 例/100 萬(wàn)人[2-5]。中國(guó)為 12.9%，低于歐洲的 19%—41%[6,7]。BP 臨床表現(xiàn)為水腫性紅正常皮膚或水腫性紅斑基礎(chǔ)上出現(xiàn)水皰、大皰和血皰，皰壁緊張圖 1.A）；BP 組織病理學(xué)特點(diǎn)為表皮下水皰形成，皰內(nèi)及真皮淺細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)（圖1.B）；直接免疫熒光（DIF）可見基膜或）C3 呈均質(zhì)或線狀沉積（圖 1.C-D）；鹽裂間接免疫熒光（IIF者血清表現(xiàn)為抗 BMZ 的 IgG 沉積于表皮側(cè)[8]。BP 病情慢性遷患者的生活質(zhì)量和身心健康造成極大影響，但其發(fā)病機(jī)制尚未完賴于系統(tǒng)應(yīng)用糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑，尚缺乏特異性治療手段P 發(fā)病機(jī)制，尋找潛在的特異性治療靶點(diǎn)一直是學(xué)科領(lǐng)域關(guān)注的

圖 2 真表皮連接蛋白結(jié)構(gòu)（Schmidt E. Lancet, 2013）[3]理因素。目前文獻(xiàn)已報(bào)道的與 BP 發(fā)病相關(guān)的物理因素有紫外線（U和紫外線 A（PUVA）、放射療法，熱或電灼傷以及外科手術(shù)，這些物理接損傷 BMZ 區(qū)域的蛋白，改變?cè)搮^(qū)域蛋白的正常抗原結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致致病和暴露因素，進(jìn)而引起的泛發(fā)全身或僅局限于局部的皮膚免疫損傷[2染因素。有研究認(rèn)為感染可以誘發(fā) BP，尤其是皰疹病毒感染，因其損大量存在，而被認(rèn)為與 BP 發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。相關(guān)研究認(rèn)為病毒插入宿主細(xì)胞，或病毒釋放的游離抗原與宿主細(xì)胞的蛋白碎片相融合好與宿主細(xì)胞有相似的抗原表位，以上原因可導(dǎo)致在機(jī)體暗藏的致病[24]。 自身抗原的提呈
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R758.66

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本文編號(hào)：2624660