發(fā)布時間：2020-04-05 18:06

【摘要】：目的:使用白癜風患者正常組織處的角質(zhì)形成細胞構建表皮層,成纖維細胞構建真皮層以及含有具有白癜風患者特異性的誘導黑素細胞在體外運用三維(3D)細胞共培養(yǎng)技術構建的皮膚模型。方法:1.從一個正常人中提取三種皮膚原代細胞構建具有個體化的正常皮膚模型。2.取白癜風病人色素減退的皮損組織后分離出原代成纖維細胞和角質(zhì)形成細胞并進行培養(yǎng),運用誘導多功能干細胞技術重編程為多功能干細胞(iPSC)后誘導分化為黑素細胞,將其與原代角質(zhì)形成細胞在體外進行共培養(yǎng)。3.從白癜風患者正常皮損出提取皮膚原代細胞以及和上述的誘導黑素細胞構建體外色素皮膚模型。結果:1.使用Alvetex Scaffold小室構建的個體化正常皮膚模型的具有角質(zhì)層,角化不明顯,真皮層不明顯;使用原代成纖維細胞和HaCaT細胞株可以成功構建全厚度的體外皮膚模型。2.黑素細胞在三維體外皮膚模型下DOPA染色呈現(xiàn)為陽性,提示具有酪氨酸酶活性。3.使用I型鼠尾膠原作為細胞外基質(zhì)可以構建正常具有個體化皮層模型。4.誘導黑素細胞的生長形狀和黑素基因相關蛋白表達與原代黑素細胞相似。5.誘導黑素細胞和原代角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)中其黑素小體具有轉運功能。6.含有白癜風患者特異性的誘導黑素細胞在體外皮膚模型中酪氨酸酶活性有陽性結果。結論:使用原代的表皮和真皮細胞運用體外三維(3D)共培養(yǎng)技術可以構建體外全厚度皮膚模型;由白癜風患者皮膚皮損處來源的誘導多功能干細胞(iPSC)誘導出的黑素細胞在形態(tài)、蛋白表達、酪氨酸酶活性以及黑素小體轉運功能上都與正常黑素細胞相似;使用白癜風患者特異性的誘導黑素細胞,包含其患者正常的角質(zhì)形成細胞構建的表皮層和成纖維細胞構建的真皮層的體外皮膚模型,可以對后期構建一個個體化的白癜風皮膚模型奠定了基礎。
【圖文】：

2.3 實驗結果2.3.1 三種原代細胞的形態(tài)學觀察原代成纖維細胞培養(yǎng) 15 天左右后，全部換液，在倒置顯微鏡下可觀察細胞貼附與培養(yǎng)皿底，胞核較大，細胞的形狀類似為紡錘形扁平狀。繼續(xù)培養(yǎng)后該細胞生長速度增快，形態(tài)均一，長滿后傳代。傳代后的細胞形態(tài)無明顯改變（如圖A），原代黑素細胞培養(yǎng) 7-10 天后，在倒置顯微鏡下觀察細胞有樹枝狀的分叉，樹突細長，折光性強，細胞生長速度一般，形態(tài)較均一（如圖 B），，細胞長滿皿底 70%進行傳代，傳代后細胞形態(tài)變化不大，隨著傳代次數(shù)增多，黑素細胞胞核變扁圓，中間有空泡，軸突增多，折光性差，原代角質(zhì)形成細胞培養(yǎng) 10 天左右可以看到胞核扁平，形態(tài)均一（如圖 C），每天換液可發(fā)現(xiàn)死細胞較多，傳代后細胞狀態(tài)可，細胞可發(fā)生鵝軟石樣疊加生長。

來自白癜風患者的誘導多功能干細胞（iPSC）分化的黑素細胞構建三維皮膚模型的研究2.3.2 運用Alvetex Scaffold 小室構建體外皮膚模型2.3.2.1 不使用 I 型鼠尾膠原作為基質(zhì)層構建全厚度皮膚模型使用 Alvetex Scaffold 小室將成纖維細胞計數(shù)后直接接種上培養(yǎng) 1 周，組織包埋切片后可以看到成纖維細胞均勻散在 Alvetex 的孔隙中構成真皮層（如圖 A），構建好真皮層后將 HaCaT 計數(shù)后接種在真皮層上培養(yǎng) 1 周，石蠟包埋切片后可看見完整的真皮層的同時也有完整的角質(zhì)層，角質(zhì)層細胞胞核均一，胞質(zhì)均一， 未有明顯角化（如圖 B）。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R758.41

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