【摘要】： 第一部分：人純化ET-1通過調(diào)節(jié)RhoA和Rac1活性對人黑素細胞樹突生成的影響 目的：探討311nm UVB對人角質(zhì)形成細胞分泌內(nèi)皮素(ET)-1的影響及人純化ET-1通過調(diào)節(jié)RhoA和Rac1活性對人黑素細胞樹突生成的作用。 方法：采用二苯基四氮唑溴鹽(MTT)法檢測311nm UVB對人角質(zhì)形成細胞存活率的影響。應用ELISA法檢測311nm UVB照射人角質(zhì)形成細胞后收集的培養(yǎng)上清液中白細胞介素(IL)-1a、ET-1和堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)的濃度。采用相差顯微鏡觀察人純化ET-1對人黑素細胞樹突生成的影響。應用pull down方法檢測人純化ET-1對人黑素細胞GTP-RhoA和GTP-Rac1蛋白的表達情況。 結(jié)果：在25和50mJ／cm~2劑量下，311nm UVB照射后24h對人角質(zhì)形成細胞的存活率分別為102.55±1.82％和100.57±1.61％，，與對照組比較無統(tǒng)計學差異；在100和200mJ／cm~2時，存活率分別下降至91.38±2.41％和80.56±3.31％，與對照組比較明顯下降，有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。在25和50mJ／cm~2劑量時，人角質(zhì)形成細胞培養(yǎng)上清液中IL—1a和ET-1的濃度與對照組比較明顯升高(P＜0.05)，其中ET-1在25mJ／cm~2時達到38.85±1.52pg／mL。未經(jīng)ET-1處理的人黑素細胞樹突多為雙極或三極，而經(jīng)ET-1處理的細胞胞體增大，樹突明顯增多，多于3個樹突(不包括3個)以上的細胞(63.67±5.51％)較未處理細胞(28.67±3.06％)明顯增多(P＜0.01)。Pull down實驗顯示人黑素細胞GTP-Rac1的表達在ET-1處理后逐漸升高，10 min時達到處理前的4倍，隨后逐漸下調(diào)，但處理60 min時仍高于處理前水平；而GTP-RhoA表達開始就明顯下降，10 min時降到處理前的1／3，之后有所回升，在處理60 min時幾乎達到處理前水平。 結(jié)論：311nm UVB具有促進人角質(zhì)形成細胞分泌ET-1及ET-1可通過活化Rac1和抑制RhoA雙重途徑促進人黑素細胞樹突生成的作用。 第二部分：311nm UVB通過活化Rac1對B16黑素瘤細胞F-actin和樹突生成的影響 目的：探討311nm UVB通過活化Rac1對B16黑素瘤細胞F-actin和樹突生成的影響。 方法：采用MTT法檢測311nm UVB對B16黑素瘤細胞存活率的影響。應用相差顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡分別觀察311nm UVB對B16黑素瘤細胞的形態(tài)學變化和細胞骨架蛋白F-actin的影響。應用pull down方法檢測311nmUVB照射前及照射后15 min、30 min、60 min和120 min B16黑素瘤細胞GTP-RhoA和GTP-Rac1蛋白的表達情況。 結(jié)果：在25、50和100mJ／cm~2劑量下，311nm UVB照射后24h對B16黑素瘤細胞的存活率與對照組比較無明顯差異(P＞0.05)；在200和300mJ／cm~2時，B16黑素瘤細胞的存活率明顯下降，存活率分別為87.75±2.66％和79.40±2.31％(P＜0.01)。311nm UVB100 mJ／cm~2照射24h后，B16黑素瘤細胞呈胞體增大近似球狀，樹突明顯增多似樹枝，與未照光細胞比較明顯增多((P＜0.01)，而未照光細胞樹突僅表現(xiàn)為雙極或三極。激光共聚焦顯微鏡顯示，B16黑素瘤細胞在饑餓24h而未經(jīng)311nm UVB照射時，細胞內(nèi)骨架蛋白張力纖維紋理清晰，而經(jīng)311nm UVB 100 mJ／cm~2照射30min和60min后細胞骨架蛋白張力纖維解聚，紋理欠清晰，并逐漸加重，在照射6h時張力纖維紋理模糊，呈團塊狀。Pull down實驗顯示，與照射前比較311nm UVB100 mJ／cm~2照射后15 min和30 min B16黑素瘤細胞GTP-Rac1蛋白的表達逐漸升高，尤其在30 min時表達是照射前的2倍之多，隨后略有下降，但在照射后60 min和120 min表達仍高于對照組；而GTP-RhoA蛋白在照射后略有下降，而后逐漸升高，在120min時升高到照射前的1.6倍。 結(jié)論：311nm UVB可通過活化Rac1誘導B16鼠黑素瘤細胞內(nèi)張力纖維F-actin的解聚，進而促進B16黑素瘤細胞胞體增大和樹突增多等形態(tài)學的改變。 第三部分：熊果苷和淫羊藿苷對人黑素細胞樹突生成及共培養(yǎng)中黑素小體轉(zhuǎn)運的影響 目的：探討熊果苷和淫羊藿苷對人黑素細胞樹突生成及細胞共培養(yǎng)中黑素小體轉(zhuǎn)運的影響。 方法：MTT法檢測熊果苷和淫羊藿苷對人黑素細胞和角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)細胞存活率的影響。相差顯微鏡觀察熊果苷和淫羊藿苷對人黑素細胞樹突生成的影響。pull down方法檢測熊果苷對人黑素細胞GTP-RhoA和GTP-Rac1蛋白的表達情況。應用流式細胞術(shù)檢測熊果苷和淫羊藿苷對共培養(yǎng)細胞中黑素小體轉(zhuǎn)運的影響。 結(jié)果：熊果苷在藥物濃度320-640 mmol／L之間時抑制細胞增殖作用明顯(P＜0.05)，在40-160 mmol／L時，抑制作用不明顯；淫羊藿苷具有促細胞生長的作用，但當藥物濃度在120-240mmol／L之間時，促增殖作用下降。經(jīng)熊果苷(160mmol／L)處理后，黑素細胞樹突退縮，樹突平均長度為110.67±7.37μm，與對照組(267±10.15μm)比較有顯著性差異(P＜0.01)；而經(jīng)淫羊藿苷處理后，黑素細胞樹突長度雖略增加(285±10.54μm)，但與對照組比較無統(tǒng)計學意義。熊果苷(160mmol／L)處理15 min后黑素細胞GTP-RhoA蛋白表達增多，30 min時達到高峰，60 min時表達出現(xiàn)下降，但在120 min表達仍高于對照組；GTP-Rac1蛋白的表達在15 min、30 min、60 min和120 min與處理前比較無顯著性改變。熊果苷和淫羊藿苷對黑素細胞和角質(zhì)形成細胞共培養(yǎng)中黑素小體轉(zhuǎn)運的抑制作用隨藥物濃度的增加而逐漸增強，以熊果苷的抑制作用明顯，在160mmol／L其抑制作用與1mmol／L的煙酰胺作用相當，抑制率為37.15±3.87％。 結(jié)論：熊果苷可通過活化RhoA誘導黑素細胞樹突退縮，進而抑制黑素小體的轉(zhuǎn)運。
【圖文】：

多巴染色進行人黑素細胞的鑒定(X200)

圖l一 1PE標記的抗角蛋白染色進行人角質(zhì)形成細胞的鑒定(x630)人角質(zhì)形成細胞PE標記的抗角蛋白染色陽性，胞漿內(nèi)見紅色*顆粒狀染圖1一2多巴染色進行人黑素細胞的鑒定(X200)黑素細胞多巴染色陽性，細胞質(zhì)及樹突呈灰色或黑色。
【學位授予單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R739.5

【引證文獻】

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1 王天曄;王興焱;陳巧云;李紹民;張寧;陳景華;;細胞共培養(yǎng)技術(shù)在美白藥物研究中的應用及前景[J];中國美容醫(yī)學;2010年09期

相關(guān)碩士學位論文 前1條

1 王天曄;山茱萸提取物對A375細胞與Hacat細胞共培養(yǎng)體系黑素合成及相關(guān)基因表達的影響[D];黑龍江中醫(yī)藥大學;2011年

本文編號：2608362