【摘要】：白癜風(fēng)是一種臨床常見的慢性色素障礙性皮膚病,主要由病變部位黑素細胞的缺失或功能喪失引起。有關(guān)白癜風(fēng)發(fā)病機制尚未完全闡明。近年來大量研究顯示氧化應(yīng)激在白癜風(fēng)黑素細胞損毀中扮演了重要角色。 正常機體處于氧化-抗氧化系統(tǒng)的動態(tài)平衡之下,打破這種平衡會導(dǎo)致機體發(fā)生氧化應(yīng)激損傷。大量證據(jù)表明白癜風(fēng)患者存在氧化-抗氧化水平失衡。白癜風(fēng)中患者表皮內(nèi)過量H_2O_2蓄積,外周血紅細胞SOD活性及脂質(zhì)過氧化水平顯著升高,血漿MDA濃度增高,外周單個核細胞中DNA鏈斷裂及DNA堿基被氧化的水平升高,皮損處MSR表達水平及活性明顯下降,Nrf2漿核分布比例失調(diào),以及氧化應(yīng)激相關(guān)基因多態(tài)性與白癜風(fēng)遺傳易感性相關(guān)的大量研究,直接或間接的證實氧化應(yīng)激在白癜風(fēng)發(fā)病中的重要作用。 microRNA(miRNA)是一類非編碼單鏈小RNA分子,長約21-22個nt,主要與其靶基因mRNA通過特異性的堿基互補配對,在轉(zhuǎn)錄后對基因進行負表達調(diào)控。既往研究顯示miRNA分子參與細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。在H_2O_2、電離輻射或依托泊甙等不同條件誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激情況下,存在多種miRNA分子表達異常改變。而在多種發(fā)病與氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病中,如心力衰竭、心肌病、神經(jīng)退行性疾病等,表達異常改變的miRNA分子發(fā)揮著促氧化反應(yīng)和抗氧化應(yīng)激的雙向調(diào)節(jié)功能,提示miRNA分子參與機體抵御應(yīng)激反應(yīng)或?qū)е聶C體氧化應(yīng)激損傷。因此,尋找與人黑素細胞氧化應(yīng)激相關(guān)的miRNA分子,研究氧化應(yīng)激條件下miRNA對黑素細胞的功能影響,探討miRNA參與黑素細胞氧化應(yīng)激的分子機制,為白癜風(fēng)機理研究和臨床治療藥物開發(fā)提供新的思路和理論依據(jù)。 方法 使用適當(dāng)濃度的H_2O_2對永生化的人表皮黑素細胞PIG1及永生化的白癜風(fēng)患者正常黑素細胞PIG3V進行處理,與處理前的PIG1及PIG3V黑素細胞進行microRNA芯片表達譜差異分析,繼而通過實時熒光定量RT-PCR進行差異表達驗證,初步篩選出相關(guān)miRNA進行功能學(xué)研究。使用篩選出的miRNA分子特異性前體及抑制物瞬時轉(zhuǎn)染PIG1及PIG3V黑素細胞,設(shè)置轉(zhuǎn)染后H_2O_2處理組,通過檢測細胞活力和凋亡,以及細胞內(nèi)ROS、MDA、SOD、GSTs的表達水平,觀察miRNA對H_2O_2處理黑素細胞氧化應(yīng)激狀態(tài)及細胞活性的影響。生物學(xué)預(yù)測軟件預(yù)測miRNA可能調(diào)控靶基因,通過報告基因試驗驗證miRNA與預(yù)測靶基因之間的關(guān)系。RT-PCR及Western Blot試驗進一步驗證miRNA對靶基因調(diào)控作用;基因轉(zhuǎn)染、Western Blot試驗和細胞活力檢測明確miR-423-5p/GSTM1信號通路在H_2O_2誘導(dǎo)下人黑素細胞氧化損傷中的作用。 結(jié)果 1.通過對miRNA芯片表達譜進行差異分析,我們發(fā)現(xiàn)在使用H_2O_2處理后,PIG1黑素細胞中有10個miRNA分子表達水平發(fā)生改變,其中7個miRNA分子表達上調(diào),3個miRNA分子表達下調(diào);而在PIG3V黑素細胞中,則有3個miRNA分子表達上調(diào),5個表達下調(diào)。有3個miRNA分子(miR-93、miR320b和miR-423-5p)在兩種黑素細胞中表達均發(fā)生改變。進一步通過實時熒光定量RT-PCR對這3個miRNA分子進行驗證,結(jié)果顯示,H_2O_2處理后miR-93和miR-320b在PIG1黑素細胞中表達較處理前下降(p0.05),在PIG3V黑素細胞中表達上調(diào)(p0.05),與芯片方向不完全相符;miR-423-5p在H_2O_2處理后的兩種黑素細胞中表達較處理前均上調(diào)(p0.05),且在PIG3V細胞處理前后表達水平具有顯著差異(p0.01),結(jié)果與芯片方向一致。 2.使用特異性miR-423-5p前體及抑制物轉(zhuǎn)染PIG1和PIG3V黑素細胞,能夠成功使黑素細胞中miR-423-5p的表達上調(diào)和下調(diào)。與未轉(zhuǎn)染組及轉(zhuǎn)染對照組相比,在H_2O_2處理后上調(diào)miR-423-5p表達的黑素細胞,細胞活力降低,凋亡比例增大,細胞內(nèi)ROS水平及MDA水平升高,而SOD、GSTs活性下降。下調(diào)miR-423-5p表達的黑素細胞活力增加,凋亡細胞減少,ROS、MDA水平降低,而SOD、GSTs活性增加。 3.通過生物學(xué)軟件我們初步預(yù)測GSTM1是miR-423-5p的靶基因。報告基因試驗結(jié)果證實,GSTM1通過3’UTR位點與miR-423-5p結(jié)合,從而受miR-423-5p的抑制。RT-PCR及Western Blot結(jié)果顯示,在H_2O_2處理后,與轉(zhuǎn)染對照組相比,特異性上調(diào)/下調(diào)miR-423-5p的表達后,GSTM1的mRNA表達無明顯變化,而蛋白水平則發(fā)生了明顯改變。進而我們通過基因轉(zhuǎn)染、Western Blot試驗和細胞活力檢測發(fā)現(xiàn),miR-423-5p不僅僅可負性調(diào)控GSTM1在H_2O_2誘導(dǎo)下人黑素細胞中的表達,并確實通過下調(diào)GSTM1蛋白表達介導(dǎo)了H_2O_2誘導(dǎo)下人黑素細胞的氧化損傷。 結(jié)論 1. miR-423-5p在H_2O_2處理前后的人黑素細胞具有表達差異,可能參與黑素細胞氧化應(yīng)激反應(yīng)。 2. miR-423-5p能夠降低H_2O_2誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激條件下人黑素細胞活力,促進黑素細胞凋亡,增加黑素細胞氧化應(yīng)激水平,降低細胞抗氧化能力。miR-423-5p是調(diào)控人黑素細胞氧化應(yīng)激損傷的危險性因素。 3. miR-423-5p通過GSTM1介導(dǎo)人黑素細胞氧化應(yīng)激損傷。GSTM1具有抗氧化能力,miR-423-5p影響人黑素細胞的抗氧化能力,導(dǎo)致人黑素細胞的氧化應(yīng)激損傷,部分是通過對GSTM1表達的負性調(diào)控來實現(xiàn)的。
【圖文】：

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文成熟加工。在細胞漿中，，pre-miRNA在Dicer酶（另一種RNase Ⅲ酶）及其輔助因子P的作用下，被剪切成具有5′端磷酸基和3′端2nt突出21-25nt長度的NA:miRNA*成熟雙鏈。在TRBP募集作用下，TRBP、Argonaute蛋白與r酶三者共同形成三聚復(fù)合物，啟動RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）的。雙鏈miRNA在解旋酶的作用下被解旋，其中5′端相對不穩(wěn)定的一條NA鏈整合進RISC，結(jié)合到與其互補的mRNA 的位點，通過堿基配對識基因發(fā)揮調(diào)控作用，另一條鏈則被特異性降解。

理濃度的增加而顯著下降。以未使用 H2O2處理的 PIG1 黑素細胞組的 OD 檢測值為 100%，當(dāng) H2O2濃度為 0.5mM 時，PIG1 黑素細胞活力開始下降(78.93±6.85)%（p<0.05）；當(dāng) H2O2濃度為 0.75mM 時，PIG1 黑素細胞活力出現(xiàn)顯著下降(56.77±8.37)%（p<0.01）（圖 1 左）。因此，我們首先將 H2O2處理濃度固定為 0.75mM。當(dāng) H2O2處理濃度固定為 0.75mM，我們分別選取H2O2處理的不同時間點檢測 PIG1 黑素細胞的活力。結(jié)果顯示：PIG1 黑素細胞活力隨 H2O2處理時間的延長而顯著下降。以未使用 H2O2處理的 PIG1 黑素細胞組的 OD 檢測值為 100%，當(dāng) H2O2處理 3h 時，PIG1 黑素細胞活力即開始下降(83.53±6.29)%（p<0.05）；當(dāng) H2O2處理 24h 時，PIG1 黑素細胞活力出現(xiàn)顯著下降(58.87±5.90)%（p<0.01）（圖 1 右）。根據(jù)上述實驗結(jié)果，我們選擇 0.75mM H2O2處理 24h 作為實驗條件進行下一步實驗，這主要是因為該濃度和時間點下 H2O2既能誘導(dǎo) PIG1 黑素細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，又不會導(dǎo)致 PIG1 黑素細胞死亡過多而影響實驗結(jié)果的分析。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號】：R758.41

【共引文獻】

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本文編號：2564004