【摘要】：研究背景 大皰性表皮松解癥(epidermolysis bullosa, EB)是表皮與真皮分離的在臨床上有多種表現(xiàn)的一組遺傳性皮膚病的總稱,根據(jù)超微結構顯示組織分裂的準確位置,EB可分為四種主要類型：單純型EB(epidermolysis bullosa simplex, EBS);交界型EB(junctional epidermolysis bullosa, JEB);營養(yǎng)不良型EB(dystrophic epidermolysis bullosa, DEB)和Kindler綜合征(Kindler syndrome)。EBS:裂隙發(fā)生在基底的角質形成細胞內,是角蛋白5、14或plectin蛋白異常所致；JEB：裂隙主要發(fā)生在透明板,是lamina-332,整聯(lián)蛋白a 6β4或ⅩⅦ型膠原異常所致；DEB：裂隙發(fā)生在致密板下錨絲纖維水平,是Ⅶ型膠原異常所致；而Kindler綜合征患者的裂隙可以發(fā)生于表真皮交界處的任何結構部位,主要由于粘著斑相關蛋白Fermitin家族同源物1蛋白異常所導致。 DEB的表皮松解部位發(fā)生于致密板下帶,根據(jù)遺傳方式的不同可分為常染色體顯性(DDEB)和常染色體隱性遺傳(RDEB)兩種類型。近年來隨著分子生物學技術的發(fā)展研究表明DEB是由位于基底膜致密板下帶錨絲纖維的主要組成部分---Ⅶ型膠原基因COL7A1突變導致。 癢疹樣營養(yǎng)不良型大皰性性表皮松解癥(dystrophic epidermolysis bullosa pruriginosa, DEBP)是DEB的一種少見臨床亞型。DEBP患者可于出生后早期表現(xiàn)為DEB的臨床表型,并隨著年齡增長,伴隨著水皰或大皰性損害減少,逐漸出現(xiàn)癢疹樣損害；患者也可以出生后無任何臨床表現(xiàn),逐漸于雙脛前緩慢出現(xiàn)癢疹樣改變,伴有輕度的甲營養(yǎng)不良性改變;少數(shù)患者可在成年后才出現(xiàn)典型的DEBP皮損而無任何其他DEB的臨床表現(xiàn)；極少數(shù)DEBP患者還可以在典型臨床表現(xiàn)的基礎上出現(xiàn)白色丘疹樣皮疹。 DEBP可呈常染色體顯性遺傳或隱性遺傳,但多數(shù)病例呈常染色體顯性遺傳。目前,已報導引起DEBP的突變包括錯義突變、移碼突變以及剪切位點突變。其中,引起COL7A1基因編碼的Ⅶ型膠原三螺旋區(qū)的甘氨酸替代的雜合錯義突變?yōu)镈EBP最常見的基因突變類型。這是由于Ⅶ型膠原蛋白結構特征是Gly-Xaa-Yaa連續(xù)重復,由于甘氨酸是最小的氨基酸,對于膠原蛋白的結構和功能至關重要,當甘氨酸被其他種類的氨基酸替代后,可能干擾Ⅶ型膠原的三螺旋結構域的形成,妨礙其結構的完整性和穩(wěn)定性,使皮膚基底膜致密板下帶錨纖維(其主要成分為Ⅶ型膠原)不能維持正常的功能,導致DEBP發(fā)生。但引起DEBP患者劇烈瘙癢并最終在反復搔抓刺激下出現(xiàn)癢疹樣改變的具體原因尚不清楚。本研究擬對收集到的3例臨床表型差異較大的DEBP病例進行COL7A1基因突變的研究,進一步探討DEBP患者臨床表型與基因型之間可能的關聯(lián),豐富DEBP突變的數(shù)據(jù)庫,為患者家系的產前診斷奠定基礎。 目的 檢測三例癢疹樣營養(yǎng)不良型大皰性表皮松解癥患者的COL7A1基因突變情況。 方法 1、收集三例患者臨床資料,病例1為17歲男性,出生后反復于手、足等摩擦部位出現(xiàn)水皰及大皰,消退后留有輕度增生性瘢痕。隨年齡增大,患者摩擦性水皰逐漸減輕,但緩慢于雙脛前、背部、上肢伸側出現(xiàn)扁平丘疹及結節(jié),伴有劇烈瘙癢,家族中其母親及多位親屬有類似情況,否認父母近親結婚。病例2和病例3均為成年女性,青春期后發(fā)病,主要表現(xiàn)雙脛前、背部逐漸增多的結節(jié),伴有劇烈瘙癢。病例2有家族史,病例3為散發(fā)病人。查體：三例患者均可見到雙脛前、背部多發(fā)的淡粉紅色或褐色扁平丘疹及結節(jié),表皮剝蝕,部分表面伴有明顯角化,其中病例1皮疹較為廣泛多發(fā),并且伴有腹部多發(fā)膚色扁平膚色或者白色丘疹及增生性瘢痕。三例患者均可見到甲變薄,遠端萎縮甚至缺如。三例患者的皮膚組織病理均提示：角化過度,棘層肥厚,表皮下輕度裂隙,真皮淺層血管周圍少量淋巴細胞浸潤。 2、電鏡檢查標本制備：環(huán)鉆鉆取病例1及病例3脛前結節(jié)處皮損一塊(3mm),立即用5%戊二醛溶液固定,送至電鏡室行透射電鏡檢測。3、DNA的提取取患者及其親屬外周血5ml,2%EDTA抗凝,以低滲溶血以及酚—氯仿抽提法提取DNA。4.PCR擴增及DNA測序根據(jù)COL7A1基因序列設計72對特異性引物擴增3例患者全部外顯子,同時擴增患者親屬及150例無關正常人對照的相應突變外顯子。擴增條件：94℃預變性5min；94℃變性45s,56℃-62℃退火1 min,72℃延伸1min,共35個循環(huán)；72℃后延伸10min。1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢查PCR產物；所有PCR產物經純化后送至北京天一輝遠測序公司測序。 結果 病例1及2有家族史,病例3為散發(fā)患者。病例1和3皮損透射電鏡顯示部分區(qū)域錨纖維絲輕度減少,病例1可見致密板下裂隙。以三例患者的基因組DNA為模板,所有72對引物在各自的條件下分別擴增出各自的產物,包括所有118個外顯子的編碼序列以及側翼序列。所有產物純化后測序結果與Ensembl網(wǎng)站所公布的COL7A1基因序列進行對照,發(fā)現(xiàn)病例1的COL7A1基因編碼外顯子的第6734位核苷酸發(fā)生G→T雜合突變,使位于85號外顯子2245位密碼子發(fā)生GGT→GTT突變,導致Gly2245Val雜合突變,其母親及家族中其他患者帶有該突變,其父親未檢測到該突變；病例2的COL 7A1基因編碼外顯子的第6859位核苷酸發(fā)生G→A雜合突變,使位于87號外顯子2287位密碼子發(fā)生GGA→AGA突變,導致Gly2287Arg雜合突變,家族中其他患者帶有該突變；病例3的CIL7A1基因編碼外顯子的第5318位核苷酸發(fā)生G→T雜合突變,使位于42號外顯子1773位密碼子發(fā)生GGT→GTT突變,導致Gly1773Val雜合突變,其未患病的父母未檢測到該突變,提示其為新發(fā)突變。突變在病例1和2家族中的患者均呈現(xiàn)共分離現(xiàn)象。所有突變均由反向測序得到驗證。150例無關正常人對照均未發(fā)現(xiàn)這三種突變。 結論 COL 7A1的p.G2245V、p.G2287R和p.G1773V甘氨酸替代突變,可能是引起這三例患者臨床表型的病因,進一步證實甘氨酸替代突變在DEBP中的重要致病意義；其中p. G2245V、p.G1773V為兩種未報道過的新突變,這豐富了DEBP的臨床表型與基因型之間的關系研究,并為此三例患者家族的產前診斷奠定了基礎。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2011
【分類號】：R758.5

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本文編號：2560368