【摘要】：目的:黑素瘤(melanoma)是目前位于首位的致死性皮膚腫瘤,其發(fā)病率呈急速上升趨勢,大多見于30歲以上的成年人,可發(fā)生于皮膚、黏膜和內(nèi)臟器官。它是由于遺傳因素、環(huán)境因素及其共同影響而引起的一種腫瘤,惡性程度極高,早期即可發(fā)生血液及淋巴道轉(zhuǎn)移,而轉(zhuǎn)移又是造成患者死亡的主要原因。隨著近代醫(yī)學分子水平的不斷發(fā)展,人們更加希望通過精準化的治療提高黑素瘤的治愈率及延長患者的生存期。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是調(diào)節(jié)血管生的最重要的細胞因子之一,尤其是對腫瘤的新生血管的調(diào)節(jié)及對腫瘤細胞發(fā)生轉(zhuǎn)移的影響非常明顯。實體腫瘤內(nèi)新生血管的形成是其生長、轉(zhuǎn)移及侵襲的重要結(jié)構(gòu)和營養(yǎng)供需的基礎(chǔ)。血管內(nèi)皮生長因子主要通過與血管內(nèi)皮細胞相應受體即血管內(nèi)皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)特異性結(jié)合,激活下游通路,促進腫瘤細胞的血管生成。在人類多種腫瘤中相繼發(fā)現(xiàn):不僅腫瘤血管內(nèi)皮的細胞可以表達VEGF受體,腫瘤細胞中也有VEGF受體的表達,而這也是腫瘤細胞中VEGF自分泌機制發(fā)揮生物學作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。VEGFR目前發(fā)現(xiàn)有3種:VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3,VEGFR-2是最主要的功能受體,可與VEGF-A、C、D結(jié)合。VEGFR-2是最主要的功能受體,其與VEGF結(jié)合后可引發(fā)內(nèi)皮細胞的一系列變化,促進腫瘤組織的血管生成、浸潤和轉(zhuǎn)移。越來越多的研究表明,VEGF及其受體在多種腫瘤中的表達含量增高:有數(shù)據(jù)顯示在肺癌組織中VEGF及VEGFR2高表達并且與肺癌組織有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期及腫瘤的分化程度密切相關(guān),提示VEGF及VEGFR2在肺癌進展過程中發(fā)揮著重要作用;也有研究不斷發(fā)現(xiàn)VEGF及其受體VEGFR2不但表達于血管內(nèi)皮細胞,在卵巢癌細胞中也存在高表達;在大腸癌患者研究中發(fā)現(xiàn)VEGFR2可促進大腸腺癌的侵襲、生長和轉(zhuǎn)移,并且vegfr2高表達的大腸癌患者預后不良。先前研究表明黑素瘤細胞高表達vegf并且高表達的vegf與黑素瘤發(fā)病及預后關(guān)系密切。而tas等人研究證實黑素瘤患者血漿中vegf水平明顯升高,且vegf的表達水平與疾病發(fā)展階段相關(guān)。人們越來越重視腫瘤血管生成在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的作用,而抑制vegf,減少血管生成,切斷腫瘤血供也成為治療腫瘤的研究熱點。靈芝屬多孔菌科真菌靈芝的子實體,是一種非常珍貴的藥食兩用菌類,具有很高的醫(yī)療及營養(yǎng)價值,靈芝在中國已有幾千年的藥用歷史,藥物療效與食用方法相關(guān)。服用后對身體有很多補益作用,可治療神經(jīng)衰弱、心律失常、高血壓,補氣活血安神,也可以防治慢性支氣管炎等疾病。靈芝多糖(ganodermalucidumpolysaeeharides,gl-ps)是從靈芝中提取的其中的主要藥效成分之一,具有增強免疫、抗機體氧化、降血糖及抗糖尿病并發(fā)癥等作用。大量臨床研究表明,靈芝多糖可通過調(diào)節(jié)免疫功能間接地抑制了腫瘤細胞的增生,也有研究顯示靈芝多糖甚至能直接殺傷腫瘤細胞。本研究采用不同的濃度gl-ps作用于b16f10黑素瘤細胞,觀察gl-ps對b16f10細胞分泌vegf及其受體vegfr2表達含量的影響,從而為黑素瘤的治療提供新的方向。方法:1.細胞來源:本實驗中使用的黑素瘤b16f10細胞來源于承德醫(yī)學院附屬醫(yī)院中心實驗室。2.實驗分組及干預:根據(jù)培養(yǎng)基中含有的靈芝多糖的濃度進行分組,具體分為0μg/ml、0.2μg/ml、0.8μg/ml、3.2μg/ml、12.8μg/ml共五個實驗組,以僅添加rpmi-1640的完全培養(yǎng)基組作為空白對照組。3.采用realtimepcr(qrt-pcr)逆轉(zhuǎn)錄技術(shù),檢測vegf及vegfr2在不同濃度gl-ps處理后的b16f10細胞在基因轉(zhuǎn)錄水平的差異表達。4.采用蛋白印跡(western-blot)技術(shù),檢測vegf及vegfr2在不同濃度gl-ps處理后的b16f10細胞中蛋白水平的差異表達。5.采用免疫組化(immunohistochemistry)方法檢測在不同濃度gl-ps處理后的各組b16f10細胞中vegf及vegfr2的表達差異。6.數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析:應用spss21.0統(tǒng)計學分析軟件對實驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析,當p值小于0.05時,表示差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果:1.實驗從基因水平檢測GL-PS對小鼠黑素瘤細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子及其受體的抑制作用:在不同濃度GL-PS作用下,常規(guī)培養(yǎng)B16F10黑素瘤細胞至匯合狀態(tài),采用RT-PCR技術(shù)檢測,結(jié)果顯示:用GL-PS處理B16F10后,VEGF的基因表達水平分別為:1.28±0.16,1.13±0.09,0.97±0.08,0.88±0.06,0.75±0.14;VEGFR2的基因表達水平分別為:1.01±0.06,1.11±0.09,0.8±0.059,0.71±0.03,0.43±0.02;隨著GL-PS濃度的不斷增高,B16F10細胞中VEGF及VEGFR2蛋白水平的表達呈降低趨勢,經(jīng)單因素方差分析,差異有顯著性((VEGF:F=7.006,P0.05;VEGFR2:F=48.033,P0.005)。2.實驗從蛋白水平檢測GL-PS對小鼠黑素瘤細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子及其受體的抑制作用:在不同GL-PS作用下,采用western-blot技術(shù)檢測,結(jié)果顯示:用GL-PS處理B16F10后,VEGF的蛋白表達水平分別為:1.63±0.47,1.77±0.16,0.74±0.07,0.82±0.07,0.41±0.10;VEGFR2的蛋白表達水平分別為:2.16±0.11,1.97±0.07,1.51±0.06,1.35±0.09,1.04±0.16;實驗結(jié)果表明,隨著GL-PS濃度的不斷增高,B16F10細胞中VEGF及VEGFR2蛋白水平的表達呈降低趨勢,經(jīng)單因素方差分析,差異有顯著性(VEGF:F=19.931,P0.005;VEGFR2:F=57.155,P0.005)。3.采用免疫組化法進一步檢測了不同濃度GL-PS處理下VEGF及VEGFR2的表達。對照組B16F10黑素瘤細胞VEGF及VEGFR2的陽性表達呈棕黃色,而用GL-PS處理后的實驗組B16F10中VEGF及VEGFR2陽性表達低于對照組,并且結(jié)果呈現(xiàn)隨濃度的增高而降低趨勢。結(jié)論:1.靈芝多糖能夠抑制小鼠黑素瘤細胞分泌血管內(nèi)皮生長因子及其受體
[Abstract]:......
【學位授予單位】：承德醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R739.5

【參考文獻】

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