【摘要】：惡性黑素瘤(malignant melanoma，MM)是皮膚腫瘤中惡性程度最高的。近年來，MM在西方國家的發(fā)病率逐年升高，我國MM的發(fā)病率雖然相對較低，但人口基數(shù)大，其絕對發(fā)病人數(shù)超過全世界發(fā)病率最高的澳大利亞。MM除進展快、惡性程度高外，還具有轉移早而廣泛的特點，常規(guī)放療和化療效果均不佳。因此，深入探討相關分子在MM轉移中的作用，進一步揭示MM的轉移機制，對MM的臨床治療將具有重要意義。 肝再生磷酸酶(phosphatase of regenerating liver，PRLs)是新近鑒定的PTP酶家族成員，包括PRL-1、PRL-2和PRL-3三個成員。其中最早被發(fā)現(xiàn)的是PRL-1，之后通過分析鼠EST數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)和鑒定了與PRL-1具有同源性的鼠PRL-3；2001年，Matter等從人的肥厚性心肌所構建的cDNA文庫中克隆獲得了人的PRL-3基因。 PRL-3與腫瘤的相關性最早出現(xiàn)于結腸癌的研究中，2001年，Saha等比較分析了正常直腸上皮細胞、直腸原發(fā)癌細胞與轉移到肝臟的直腸癌細胞之間PRL-3表達的差異。結果表明，PRL-3基因在正常細胞與原發(fā)癌細胞中的表達均處于較低水平，在惡性程度較高的癌細胞中有中等水平的表達，而在轉移到肝臟的腫瘤細胞中表達水平非常高，并且這一結果在檢測的所有病例中呈現(xiàn)出高度的一致性，提示PRL-3與直腸癌的轉移密切相關。Saha等的研究首次揭示了PRL-3與腫瘤轉移之間的關系，此后關于PRL-3在腫瘤細胞系和腫瘤組織中的表達及其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、浸潤、轉移中的作用的研究不斷增多，例如先后發(fā)現(xiàn)PRL-3在胃癌、肝癌、卵巢癌、乳腺癌和肺癌組織中高表達，這種高表達與腫瘤的分化程度及轉移情況密切相關，通過siRNA干擾技術抑制PRL-3的表達，可明顯降低多種腫瘤細胞的增殖和侵襲能力，而轉染PRL-3使其高表達可使腫瘤細胞的增殖和侵襲能力增強。這些結果均表明PRL-3在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，尤其是侵襲和轉移中發(fā)揮重要的作用。 最近的研究表明，在中、高轉移性的MM細胞株B16-BL6中，PRL-3的表達水平明顯高于低轉移MM細胞株B16。將PRL-3轉染到B16細胞后，其遷徙和浸潤能力及伸展速度明顯提高，尾靜脈注射給裸鼠后，轉染了PRL-3的B16細胞組能形成更大和更多的肝、肺MM轉移灶。這一研究激起了我們深入探索PRL-3在MM侵襲和轉移中的作用的興趣。 主要實驗方法： 1）取皮內痣、原位黑素瘤、浸潤性黑素瘤、伴淋巴結轉移的黑素瘤和黑素瘤淋巴結轉移灶標本，免疫組化分析PRL-3蛋白的表達水平； 2） RT-PCR分析5個MM細胞系WM793B、1205Lu、451Lu、WM-266-4和C32TG中PRL-3mRNA的表達水平，Western blot分析PRL-3蛋白表達水平； 3）選擇PRL-3低表達的惡性黑素瘤WM793B細胞和PRL-3高表達的惡性黑素瘤451Lu細胞，Transwell實驗分析兩種細胞的體外侵襲能力，裸鼠皮下和尾靜脈分別注射兩種細胞，分析裸鼠體內MM的形成和轉移； 4）選擇PRL-3高表達的惡性黑素瘤451Lu細胞，siRNA轉染，RT-PCR分析siRNA轉染后PRL-3mRNA的表達水平，Western blot分析siRNA轉染后PRL-3蛋白表達水平； 5）siRNA轉染抑制惡性黑素瘤451Lu細胞PRL-3的表達后，光鏡下觀察451Lu細胞形態(tài)的變化，MTT法分析siRNA轉染對451Lu細胞增殖的影響，流式細胞儀分析siRNA轉染451Lu細胞的凋亡率，分別用細胞劃痕實驗和Transwell實驗分析siRNA轉染對惡性黑素瘤451Lu細胞遷移能力和體外侵襲能力的影響； 6）依據(jù)PRL-3的siRNA序列構建干涉PRL-3的慢病毒shRNA載體�？瞻讓φ战M裸鼠皮下接種未經(jīng)任何處理的黑素瘤細胞，空載體組裸鼠皮下接種僅以病毒空載體感染的黑素瘤細胞，實驗組裸鼠皮下接種慢病毒shRNA感染的黑素瘤細胞，觀察腫瘤生長情況，每3天測量腫瘤長和寬，計算腫瘤體積； 7）裸鼠尾靜脈注射黑素瘤451Lu細胞(對照組)和PRL-3慢病毒shRNA感染的451Lu細胞，，3周后小鼠脫頸處死，切取肝臟、肺臟，肉眼觀察各組小鼠肝臟、肺表面轉移腫瘤數(shù)量，觀察腫瘤成瘤情況及肝、肺轉移情況。 主要研究結果和結論： 免疫組化結果顯示在不伴有淋巴結轉移的浸潤性黑素瘤中，PRL-3的陽性率明顯高于皮內痣(P 0.01)，而伴有淋巴結轉移的黑素瘤組織和淋巴結轉移灶中PRL-3的陽性率明顯高于原位黑素瘤，差異有統(tǒng)計學意義(P 0.01)；同時，在伴有淋巴結轉移的黑素瘤組織(P 0.05)和淋巴結轉移灶(P 0.01)中，PRL-3的表達陽性率也明顯高于不伴有淋巴結轉移的浸潤性黑素瘤。這些結果表明，MM發(fā)生過程中PRL-3蛋白的表達增加，尤其是發(fā)生轉移時，PRL-3的表達水平會大幅度增加，說明PRL-3可能參與了MM轉移的過程。分別用RT-PCR和Western blot分析WM793B、1205Lu、451Lu、WM-266-4和C32TG5個黑素瘤細胞系PRL-3mRNA和蛋白的表達水平，發(fā)現(xiàn)WM793B和C32TG細胞系中PRL-3表達水平較低，WM-266-4細胞系表達略高，而1205Lu和451Lu細胞系尤其是451Lu細胞系PRL-3表達水平最高。Transwell實驗表明PRL-3高表達的451Lu細胞體外侵襲能力明顯高于PRL-3低表達的WM793B細胞，且451Lu細胞的體內成瘤能力和轉移能力也明顯高于WM793B細胞。 選擇PRL-3表達最高的451Lu細胞，進行siRNA轉染抑制PRL-3的表達，RT-PCR和Western blot驗證了siRNA轉染成功抑制了PRL-3mRNA和蛋白的表達，光鏡下觀察發(fā)現(xiàn)siRNA轉染細胞變得更加粗短，類似上皮細胞。與空白對照組和脂質體組相比，其生長曲線右偏，細胞增殖速度減慢，凋亡率升高(P 0.01)。細胞劃痕實驗發(fā)現(xiàn)siRNA轉染組在相同時間內發(fā)生定向遷移的細胞數(shù)比空白對照組和脂質體組要少得多。Transwell試驗結果顯示，siRNA轉染組穿膜細胞數(shù)明顯少于空白對照組和脂質體組（P均0.05）。我們依據(jù)PRL-3的siRNA序列構建了干涉PRL-3的慢病毒shRNA載體，裸鼠皮下分別接種未經(jīng)任何處理的黑素瘤細胞作為對照、病毒空載體感染的黑素瘤細胞和慢病毒shRNA感染的黑素瘤細胞，在第18天（P 0.05）、第21天和第24天（P均0.01），慢病毒shRNA感染組細胞皮下接種形成的腫瘤明顯小于對照組和空載體組。裸鼠尾靜脈分別注射黑素瘤451Lu細胞(對照組)和PRL-3慢病毒shRNA感染的451Lu細胞，3周后發(fā)現(xiàn)慢病毒shRNA干擾PRL-3后小鼠形成轉移瘤的數(shù)量明顯少于對照組。 本課題分析了MM組織和MM細胞系PRL-3的表達情況，發(fā)現(xiàn)PRL-3的表達水平與MM轉移相關，進一步選擇PRL-3高表達的惡性黑素瘤451Lu細胞，干擾PRL-3的表達后其細胞形態(tài)發(fā)生變化，增殖能力減弱、凋亡增加，且體外遷移能力、侵襲能力減弱，體內成瘤能力和轉移能力也明顯減弱，表明PRL-3在MM的增殖和轉移中發(fā)揮著重要的作用，抑制PRL-3的表達和功能可以抑制MM的增殖和轉移，對PRL-3的抑制有望成為治療MM的新靶點。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R739.5

【參考文獻】

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本文編號：2406791