發(fā)布時(shí)間：2018-12-27 08:41

【摘要】：自身免疫性疾病(Autoimmune disease,AID)是一類由多種因素導(dǎo)致的慢性炎癥性疾病,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,至今尚未完全闡明。目前臨床治療這類疾病的藥物療效不佳,副作用大,導(dǎo)致疾病反復(fù)發(fā)作。越來越多的研究顯示,AID與固有免疫和適應(yīng)性免疫紊亂密切相關(guān)。其中,在固有免疫系統(tǒng)激活過程中,模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRRs)扮演著重要角色,它們能特異性識(shí)別病原相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs),從而活化相關(guān)信號(hào)通路導(dǎo)致一系列免疫炎癥反應(yīng)。然而正是這些受體的過度活化,導(dǎo)致一系列AID的發(fā)生,如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA),系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)和銀屑病(Psoriasis)。那么,探索并圍繞AID發(fā)病機(jī)制尋找藥物靶標(biāo),已成為當(dāng)今治療免疫性疾病的突破口。重要的PRRs有Toll樣受體(TLRs)和NOD樣受體(NLRs),它們能夠特異性地識(shí)別病毒、細(xì)菌、真菌和寄生蟲特定的組分,構(gòu)成了固有免疫的第一防線。在TLRs家族中,根據(jù)其亞細(xì)胞定位可分為兩大類,即:細(xì)胞膜表面TLRs(TLR4/MD-2,TLR1,TLR2和TLR6)和位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和內(nèi)體上的細(xì)胞內(nèi)型TLRs(TLR3,TLR7/8和TLR9)。然而,值得注意的是,第一、TLRs受體的識(shí)別具有特異性,比如:TLR3和TLR7/8識(shí)別病毒dsRNA和ssRNA,而TLR9識(shí)別微生物DNA產(chǎn)生的未甲基化Cp G基序;第二、不同的TLRs對(duì)應(yīng)的下游信號(hào)通路不同,如:TLR3通過TRIF信號(hào)通路,TLR7通過MyD88,導(dǎo)致大量炎癥因子(TNF-ɑ、IL-6和干擾素等)的釋放。NLRs作為另一類重要的細(xì)胞內(nèi)型PRRs,參與識(shí)別宿主來源和微生物的損傷相關(guān)分子(damage associated molecular patterns,DAMPs)。其中NLRP3作為NLRs蛋白家族成員之一,廣泛表達(dá)于DCs和巨噬細(xì)胞。由NLRP3、ASC和無活性的caspase-1前體組成的復(fù)合體稱為NLRP3炎癥小體,具有調(diào)控機(jī)體慢性炎癥反應(yīng)的功能,是內(nèi)源性或外源性危險(xiǎn)信號(hào)的胞質(zhì)內(nèi)感受器。它能夠活化caspase-1,調(diào)控IL-1β和IL-18等促炎因子的成熟和分泌。近年來,越來越多的研究顯示AID與固有免疫中的多種PRRs的過度活化密切相關(guān)。然而,不同PRRs具有各自對(duì)應(yīng)的信號(hào)通路,這種多對(duì)多的方式,使得在信號(hào)通路上尋找治療靶位,變得尤為復(fù)雜。為了對(duì)抗這種多因子誘發(fā)的炎癥反應(yīng),目前的藥物開發(fā)側(cè)重于效應(yīng)階段的遏制,譬如,在治療銀屑病時(shí),采用TNF-?、IL-17或IL-23的抗體。盡管這種后端靶標(biāo)的治療策略,能夠改善炎癥因子發(fā)生后續(xù)的免疫損傷,但是對(duì)免疫的干預(yù)面太大,而伴隨著免疫系統(tǒng)損耗,嚴(yán)重感染等不良反應(yīng)。因此,如果在致病前端過程,尋找有效的靶標(biāo),阻斷免疫系統(tǒng)激活,降低副作用,這將是一個(gè)更好的策略。但前端受體較多,目前仍然沒有發(fā)現(xiàn)合適的靶標(biāo)與藥物。我們前期報(bào)道了一段包含未甲基化Cp G結(jié)構(gòu)的20bp寡聚核苷酸(CpG-ODN)序列,命名為CpG-c41(5'-TGGCGCGCACCCACGGCCTG-3'),可高效抑制TLR9介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。后來研究發(fā)現(xiàn),CpG-c41亦可顯著抑制TLR7的活化,改善由酵母多糖(Zymosan)誘導(dǎo)的RA炎癥,說明其具有了成藥可能。然而,CpG-c41安全性如何,對(duì)其它TLRs是否也有影響,是否對(duì)于AID起到很好的治療作用。為了探究CpG-c41在一定范圍內(nèi)的安全性和免疫學(xué)作用特點(diǎn),在本課題我們進(jìn)行了以下研究:目的對(duì)通過生物信息學(xué)技術(shù),高通量篩選出的無免疫刺激性CpG-c41分子,進(jìn)行初步安全性評(píng)價(jià);探究其對(duì)不同TLRs介導(dǎo)的免疫學(xué)效應(yīng)的影響及其機(jī)制;構(gòu)建咪喹莫特乳膏(Imiquimod,IMQ)誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型,觀察CpG-c41對(duì)該模型的治療作用。方法1、CpG-c41初步安全性評(píng)價(jià)動(dòng)物急性毒性試驗(yàn),Balb/c小鼠12只,雌雄各半,分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組6只。實(shí)驗(yàn)組一次性尾靜脈注射治療劑量10倍(80mg/kg)的CpG-c41,對(duì)照組尾靜脈注射等體積生理鹽水(norman saline,NS),初步觀察CpG-c41對(duì)動(dòng)物的急性危害性質(zhì)和危害強(qiáng)度。體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn),通過CCK-8實(shí)驗(yàn)觀察高濃度下CpG-c41(2-64μM)對(duì)于L929細(xì)胞活性的影響。2、CpG-c41對(duì)不同TLRs介導(dǎo)的免疫學(xué)效應(yīng)研究(1)CpG-c41對(duì)不同TLRs介導(dǎo)的炎癥因子釋放的影響體外實(shí)驗(yàn),使用TLR2,3,4,7/8,9激動(dòng)劑分別刺激BMDMs,BMDCs和Thp-1細(xì)胞,另外聯(lián)合使用TLR3,7/8,9激動(dòng)劑中的兩種刺激RAW264.7,同時(shí)給予Cp G-c41(4μM)進(jìn)行干預(yù)。24h后ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞上清中TNF-ɑ、IL-6表達(dá)水平。各激動(dòng)劑終濃度:TLR2激動(dòng)劑(Zymosan,200μg/ml),TLR3激動(dòng)劑(Poly(I:C),100μg/ml),TLR4激動(dòng)劑(LPS,100ng/ml),TLR7激動(dòng)劑(Imiquimod,2μg/ml),TLR7/8激動(dòng)劑(ss RNA120,30μg/ml)與DOTAP混合后使用,TLR7激動(dòng)劑(R848,0.2μg/ml)和TLR9激動(dòng)劑(Cp G-1826,2μM)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn),野生型(WT)小鼠(18-20g)腹腔分別注射TLR3,7,9激動(dòng)劑,治療組尾靜脈注射CpG-c41(320μg/20g),安慰劑組尾靜脈注射等體積生理鹽水。ELISA檢測(cè)各組各時(shí)相點(diǎn)血清中TNF-ɑ、IL-6、IFN-ɑ和IL-12/23p40的水平。各激動(dòng)劑終濃度:TLR3激動(dòng)劑(polyI:C,40μg/20g),TLR7激動(dòng)劑(R848,10μg/20g)和TLR9激動(dòng)劑(Cp G-1826,160μg/20g)。(2)CpG-c41對(duì)胞內(nèi)型TLRs介導(dǎo)的炎癥小體形成和活化的干擾使用TLR3,4,7,9激動(dòng)劑分別刺激WT BMDMs和RAW264.7細(xì)胞,同時(shí)給予Cp G-c41(8μM)進(jìn)行干預(yù),4h后加入ATP誘導(dǎo)30min。Western blot檢測(cè)各組在BMDMs細(xì)胞中NLRP3和Caspase-1蛋白變化;ELISA檢測(cè)RAW264.7細(xì)胞上清中IL-1β的水平。各激動(dòng)劑終濃度:TLR3激動(dòng)劑(Poly(I:C),100μg/ml),TLR4激動(dòng)劑(LPS,100ng/ml),TLR7激動(dòng)劑(R848,1μg/ml)和TLR9激動(dòng)劑(CpG-1826,3μM)(3)CpG-c41多重免疫抑制效應(yīng)與TLR9的關(guān)系分離培養(yǎng)TLR9-/-BMDMs,使用TLR3,7,9激動(dòng)劑刺激,同時(shí)給予Cp G-c41(4μM)進(jìn)行干預(yù)。24h后ELISA檢測(cè)各組細(xì)胞上清中TNF-ɑ、IL-6表達(dá)水平。各激動(dòng)劑終濃度:TLR3激動(dòng)劑(polyI:C,100μg/ml),TLR7激動(dòng)劑(Imiquimod,2μg/ml),TLR7/8激動(dòng)劑(R848,0.2μg/ml)和TLR9激動(dòng)劑(CpG-1826,2μM)。3、CpG-c41對(duì)于銀屑病的治療作用研究使用IMQ(45 mg/鼠)誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠模型,治療組皮下注射CpG-c41(320μg/鼠),安慰劑組皮下注射等體積生理鹽水。連續(xù)6天,每天觀察各組皮膚損傷情況,進(jìn)行PASI評(píng)分。與此同時(shí)取第24h、72h和7天的損傷皮膚,對(duì)主要免疫細(xì)胞(巨噬細(xì)胞,T細(xì)胞)以及關(guān)鍵性細(xì)胞因子(IL-23p19)進(jìn)行原位免疫熒光染色,觀察浸潤(rùn)情況。同時(shí)第7天取損傷皮膚做病理切片。結(jié)果1、CpG-c41初步安全性評(píng)價(jià)動(dòng)物急性毒性實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均未出現(xiàn)明顯不良癥狀;L929細(xì)胞毒性試驗(yàn)顯示,各梯度濃度Cp G-c41組L929細(xì)胞活性與對(duì)照組無差異(p0.05)。表明,在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi),作為核酸序列的CpG-c41安全性良好。2、CpG-c41選擇性抑制胞內(nèi)型TLRs介導(dǎo)的免疫反應(yīng)(1)CpG-c41降低胞內(nèi)型TLRs介導(dǎo)的炎癥因子釋放DCs和巨噬細(xì)胞是主要的固有免疫細(xì)胞,表達(dá)多種TLRs。所以我們以BMDMs和BMDCs細(xì)胞為對(duì)象,采用不同的TLRs激動(dòng)劑進(jìn)行刺激,同時(shí)加入Cp G-c41進(jìn)行干預(yù)。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),各TLRs激動(dòng)劑均能誘導(dǎo)大量TNF-α和IL-6的產(chǎn)生。而Cp G-c41選擇性的抑制TLR3、7和9激動(dòng)劑誘導(dǎo)的炎癥因子釋放(P0.01),但是對(duì)于TLR2/4無此作用(P0.05)。由于小鼠免疫細(xì)胞不表達(dá)TLR8,所以我們使用人THP-1為研究細(xì)胞。使用本課題組前期開發(fā)的TLR7/8激動(dòng)劑ssRNA120進(jìn)行刺激,同時(shí)加入CpG-c41進(jìn)行干預(yù)。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),ss RNA120能誘導(dǎo)該細(xì)胞產(chǎn)生大量前炎癥因子。而Cp G-c41能夠顯著抑制這些因子的釋放(P0.01)。TLR3,7/8和9屬于胞內(nèi)型受體,而TLR2/4屬于細(xì)胞膜表面受體,根據(jù)上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Cp G-c41能夠顯著抑制TLR3、7、8和9的活化,說明Cp G-c41能夠有效抑制胞內(nèi)型TLRs介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。隨之我們觀察了Cp G-c41對(duì)于兩種胞內(nèi)型TLRs共活化的影響。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,CpG-c41能夠顯著降低兩種胞內(nèi)型TLRs激動(dòng)劑誘發(fā)的細(xì)胞因子產(chǎn)生(P0.01)。表明Cp G-c41亦可同時(shí)抑制兩種胞內(nèi)型TLRs的活化。在動(dòng)物水平,我們研究了Cp G-c41對(duì)于小鼠體內(nèi)胞內(nèi)型TLRs活化的影響。向小鼠體內(nèi)腹腔注射胞內(nèi)型TLRs激動(dòng)劑刺激,同時(shí)尾靜脈注射CpG-c41進(jìn)行干預(yù)。ELISA檢測(cè)各時(shí)相點(diǎn)血清顯示,各TLRs激動(dòng)劑能夠在1-3h內(nèi)誘導(dǎo)小鼠體內(nèi)免疫細(xì)胞產(chǎn)生大量細(xì)胞因子。而Cp G-c41能夠顯著抑制多種細(xì)胞因子的釋放(P0.01)。(2)CpG-c41抑制胞內(nèi)型TLRs介導(dǎo)的炎癥小體形成和活化Western blot和ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)LPS、R848和CpG-1826能夠有效誘導(dǎo)NLRP3表達(dá),caspase-1的產(chǎn)生和IL-1β的釋放,而CpG-c41選擇性降低由TLR7和9介導(dǎo)的這一效應(yīng)(P0.01),對(duì)于TLR4介導(dǎo)的無影響(P0.05)。有報(bào)道稱,TLR3激動(dòng)劑也可有效誘導(dǎo)NLRP3炎癥小體的形成和活化,但在本次實(shí)驗(yàn)中未能檢測(cè)該效應(yīng)。(3)CpG-c41多重免疫抑制效應(yīng)非依賴于TLR9我們以TLR9-/-BMDMs細(xì)胞為研究對(duì)象,觀察TLR9在Cp G-c41發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)中扮演的角色。ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn),TLR9激動(dòng)劑CpG-1826未能誘導(dǎo)TLR9-/-BMDMs產(chǎn)生大TNF-ɑ和IL-6,說明TLR9敲除成功。TLR3和7激動(dòng)劑能夠刺激TLR9-/-BMDMs產(chǎn)生大量TNF-ɑ和IL-6,而CpG-c41干預(yù)后,炎癥因子水平明顯降低(P0.01)。結(jié)果提示Cp G-c41抑制胞內(nèi)型TLRs的活化非依賴于TLR9.3、CpG-c41有效改善IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠皮膚損傷與安慰劑組相比,Cp G-c41治療組皮損癥狀明顯減輕,皮膚較光滑,鱗屑稀少,紅斑色淺,浸潤(rùn)增厚較輕,PASI評(píng)分顯著降低(P0.01)。而病理切片顯示乳頭瘤樣增生,棘層肥厚,角化不全得到改善。并且CpG-c41治療組巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞浸潤(rùn)數(shù)量和IL-23p19釋放量明顯低于安慰劑組(P0.01)。結(jié)論1、CpG-c41在高劑量下對(duì)于動(dòng)物和細(xì)胞均未發(fā)現(xiàn)急性毒副作用,同時(shí)由于Cp G-ODN與核酸代謝類似,初步提示在實(shí)驗(yàn)范圍濃度內(nèi),CpG-c41安全性良好。2、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)一致顯示,Cp G-c41有效抑制胞內(nèi)型TLRs介導(dǎo)的炎癥反應(yīng),并且能夠有效抑制由胞內(nèi)型TLRs介導(dǎo)的炎癥小體形成和活化。而這種多重免疫抑制效應(yīng)在TLR9-/-條件下仍然存在,表明Cp G-c41的免疫抑制效應(yīng)機(jī)制非依賴于TLR9。3、CpG-c41能夠顯著阻斷銀屑病樣小鼠模型皮損處免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥因子的產(chǎn)生,病情得到改善,鱗屑減少。提示Cp G-c41可有效緩解IMQ誘導(dǎo)的銀屑病樣小鼠模型皮損癥狀。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R758.63

【參考文獻(xiàn)】

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1 劉延剛;陳永春;宗英;馬秀娟;陳基快;袁伯俊;陸國(guó)才;;NLRP3炎癥小體的活化及調(diào)控機(jī)制[J];第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2016年07期

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本文編號(hào)：2392795