【摘要】： 目的:惡性黑色素瘤(malignant malanoma,MM)是一種主要發(fā)生于皮膚由黑色素細(xì)胞惡化形成的能夠產(chǎn)生黑色素嚴(yán)重威脅人們生命的高度惡性腫瘤,其生物學(xué)行為高度惡性,具有侵襲組織和持續(xù)增殖能力,并可逃避免疫監(jiān)視。目前為止還沒有有效的預(yù)防治療方法,外科手術(shù)仍然是現(xiàn)在治療黑色素瘤的首選方法,但是即便外科手術(shù)切除,預(yù)后仍很不理想,進(jìn)展期此腫瘤患者平均的生存時間僅為6~9個月。因此,初步研究阿維A酸治療惡性黑色素瘤的作用及其機(jī)制,探討作用機(jī)制是否與阿維A酸影響Livin、bFGF的表達(dá)有關(guān),進(jìn)而為臨床誘導(dǎo)分化治療黑色素瘤提供實驗基礎(chǔ)。 維甲酸類(retinoids)包括維生素A的天然和人工合成的衍生物。它對上皮細(xì)胞有抑制其異常增殖和分化的作用,并可促進(jìn)上皮組織正常角化,溶解角質(zhì)使其恢復(fù)正常的作用,在臨床上已用來預(yù)防及治療多種皮膚病。近來科學(xué)研究表明,維甲酸還具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)分化抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用,具有明顯的時間依賴性和濃度依賴性。 方法: 1細(xì)胞培養(yǎng) 在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含青霉素100U/ml,含鏈霉素100U/ml,PH7.2)中培養(yǎng)B16細(xì)胞,置于飽和濕度、37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)做常規(guī)傳代培養(yǎng)。 2四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)比色法 檢測阿維A對B16細(xì)胞增殖的抑制作用。采用濃度不同的阿維A(0.1 umol/L、1umol/L、10umol/L、100umol/L)作用不同時間(24、48、72小時)后,檢測對B16細(xì)胞增殖的抑制作用。 3倒置相差顯微鏡及HE染色法 觀察經(jīng)過不同濃度藥物處理后B16細(xì)胞的分化及形態(tài)變化并同時把細(xì)胞HE染色后進(jìn)行觀察。 4免疫細(xì)胞化學(xué)s-p法 檢測經(jīng)不同濃度藥物處理后的B16細(xì)胞Livin及堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF)蛋白的表達(dá)狀況。 5流式細(xì)胞分析技術(shù) 檢測細(xì)胞周期變化及凋亡的進(jìn)展,將實驗分為5組,分別為陰性對照組(不加任何藥物),阿維A濃度分別為0.1 umol/L,1 umol/L, 10umol/L,100 umol/L各一組。各組不同濃度藥物處理48小時之后,收集細(xì)胞,應(yīng)用流式細(xì)胞儀,檢測各組細(xì)胞周期分布、細(xì)胞凋亡情況及Livin、bFGF蛋白表達(dá)狀況。 6統(tǒng)計軟件SPSS13.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。 結(jié)果: 1 MTT比色分析法檢測 結(jié)果顯示阿維A酸對B16細(xì)胞增殖有顯著的抑制作用(相對抑制率),各個組間的差別有顯著性,并且不同濃度阿維A酸作用于小鼠B16細(xì)胞后所產(chǎn)生的抑制作用表現(xiàn)出顯著的時間依賴效應(yīng)關(guān)系和劑量依賴效應(yīng)關(guān)系。 2阿維A酸對B16細(xì)胞形態(tài)及分化的影響 陰性對照組:B16細(xì)胞呈梭形或多角形,貼壁生長良好,透明,折光性好,增殖旺盛;經(jīng)阿維A酸處理B16細(xì)胞后,細(xì)胞變圓,貼壁差,生長不佳,折光性減弱,核固縮現(xiàn)象增多,皺縮,并且出現(xiàn)小部分無細(xì)胞生長區(qū)及細(xì)胞漂浮等現(xiàn)象增多,而且隨著阿維A處理時間的延長及濃度的增加上述現(xiàn)象變得更加明顯嚴(yán)重。 3免疫細(xì)胞化學(xué)s-p法檢測B16細(xì)胞Livin、bFGF蛋白表達(dá)情況 Livin、bFGF蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞漿內(nèi),DAB染色為深棕黃色。經(jīng)不同濃度藥物處理后的細(xì)胞蛋白陽性表達(dá)的程度不同,陰性對照組細(xì)胞表達(dá)較強(qiáng),隨著藥物濃度的增加染色程度都有不同程度的減弱,并且差異有顯著性(p0.05)。 4流式細(xì)胞術(shù)檢測經(jīng)不同濃度藥物作用后,細(xì)胞的周期、凋亡變化 流式細(xì)胞術(shù)檢測顯示:G1期延滯,G1-S期轉(zhuǎn)化抑制,G0/G1期的比例上升,S期細(xì)胞的比例減少。 5流式細(xì)胞術(shù)測定不同濃度藥物作用后,B16細(xì)胞Livin、bFGF蛋白的表達(dá) 經(jīng)不同濃度藥作用作用后,與陰性對照組相比,表達(dá)Livin、bFGF的陽性細(xì)胞數(shù)逐漸降低,經(jīng)阿維A酸作用細(xì)胞48小時后,各組Livin蛋白表達(dá)熒光指數(shù)(FI)分別為1.6500、1.4215、1.2100、1.1124,bFGF蛋白表達(dá)熒光指數(shù)(FI)分別為1.8421、1.6446、1.4300、1.2218。把數(shù)據(jù)分別進(jìn)行兩兩比較,之間的差異均有顯著性(p0.05)。 結(jié)論: 1維A酸可以抑制B16細(xì)胞增殖,而且在一定時間和濃度范圍內(nèi),對B16細(xì)胞增殖的抑制具有時間依賴性和量效依賴性。 2四個濃度的阿維A酸均可以影響小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16從G0/G1期進(jìn)入S期,然而誘導(dǎo)B16細(xì)胞凋亡的作用并不十分得明顯。 3阿維A酸對B16細(xì)胞增殖的抑制作用可能與下調(diào)凋亡抑制因子Livin和堿性成纖維因子bFGF的表達(dá)有關(guān)。這有可能是其抗腫瘤增殖和誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化的機(jī)制之一。
[Abstract]:Objective: MALIGNANT MALIGNANT (MM) is a highly malignant tumor which is mainly caused by the deterioration of the skin caused by the deterioration of the melanocytes. The biological behavior of the malignant melanoma is highly malignant and has the ability to attack the tissue and the continuous proliferation. and immune surveillance can be avoided. So far, there is no effective method of prevention and treatment, and surgery is still the first choice for the treatment of melanoma, but even if the surgery is removed, the prognosis is still not ideal, and the average survival time of this tumor patient is only 6-9 months. Therefore, the role of AVIA in the treatment of malignant melanoma and its mechanism were studied, and whether the mechanism of action was related to the expression of Livin and bFGF in the AlveA acid, and further provided an experimental basis for the clinical-induced differentiation of melanoma. Retinoids include natural and synthetic vitamin A It has the effects of inhibiting the abnormal proliferation and differentiation of epithelial cells, promoting the normal keratinization of epithelial tissue, dissolving the cutin, and restoring normal function, and has been used in the prevention and treatment of various kinds of epithelial cells. Dermatology. Recent scientific research has shown that retinoic acid also has a strong induction. Differentiation-inhibiting the proliferation of tumor cells, with significant time-dependence and concentration dependence. Method: 1 Cell culture was cultured in RPMI-1640 medium containing 10% fetal bovine serum (including penicillin 100U/ ml, streptomycin containing 100U/ ml, pH 7.2), and then placed in saturated humidity, 37 鈩，

本文編號：2367587