【摘要】：目的黑色素瘤是惡性程度最高的皮膚腫瘤之一,占據(jù)皮膚癌死亡率的80%。隨著對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中,免疫系統(tǒng)所發(fā)揮的作用和機(jī)制的了解,免疫療法在黑色素瘤的治療中備受關(guān)注,目前也已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展。由于黑色素瘤能夠表達(dá)特異性的抗原,因此利用黑色素瘤抗原制備腫瘤疫苗用于黑色素瘤的治療被認(rèn)為是一種具有潛力的治療黑色素瘤免疫方法。DC腫瘤疫苗是指通過(guò)體外分離DC,荷載腫瘤抗原,并進(jìn)行相應(yīng)處理增強(qiáng)其免疫刺激能力,回輸至患者體內(nèi),通過(guò)激發(fā)腫瘤特異性免疫反應(yīng)進(jìn)行腫瘤治療的一類腫瘤疫苗。在DC腫瘤疫苗制備中,在荷載腫瘤抗原的基礎(chǔ)上,輔以佐劑處理DC腫瘤疫苗,能夠有效地促進(jìn)DC的成熟,改善疫苗的治療效果。因而,篩選可用于DC疫苗制備的有效佐劑是DC疫苗制備中的關(guān)鍵問(wèn)題。基于TLR激動(dòng)劑具有促進(jìn)DC成熟的作用,其常被用作制備DC腫瘤疫苗的佐劑。近來(lái),一個(gè)新型的TLR激動(dòng)劑HP-NAP,在刺激免疫應(yīng)答及抗腫瘤中的作用受到廣泛關(guān)注。在本工作中,我們利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)了HP-NAP,并進(jìn)一步對(duì)其促進(jìn)DC成熟,作為抗黑色素瘤DC疫苗佐劑的潛力進(jìn)行了研究。以期獲得一種有效地用于制備抗黑色素瘤DC疫苗的佐劑。方法1.利用實(shí)驗(yàn)室前期保存的p ET28a-His-NAP-E.coli BL21(DE3)菌株誘導(dǎo)表達(dá)HP-NAP,經(jīng)親和層析法純化得到純HP-NAP蛋白,去除內(nèi)毒素后保存于-80℃冰箱備用。2.取C57BL/6小鼠骨髓細(xì)胞,經(jīng)GM-CSF和IL-4誘導(dǎo)分化得到DC。3.以不同濃度的HP-NAP,對(duì)C57BL/6小鼠來(lái)源的DC進(jìn)行刺激。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)DC表面共刺激分子CD80、CD86的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè);熒光定量PCR法測(cè)定細(xì)胞因子IL-12、IL-1β在m RNA水平表達(dá)的變化。確定HP-NAP發(fā)揮作用的最適濃度。4.分別對(duì)野生型和TLR2缺陷型C57BL/6小鼠來(lái)源的DC給以相同濃度的HP-NAP刺激,流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其表面共刺激分子CD80的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),確定HP-NAP對(duì)DC的刺激作用是否依賴于TLR2信號(hào)通路。5.向DC培養(yǎng)體系中加入B16F10-TCL和HP-NAP進(jìn)行刺激。流式細(xì)胞術(shù)對(duì)DC表面共刺激分子CD80、CD86,趨化因子受體CCR7的表達(dá)變化以及DC抗原吞噬能力進(jìn)行檢測(cè);熒光定量PCR法對(duì)DC表達(dá)細(xì)胞因子IL-12、IL-23及IL-1β在m RNA水平的表達(dá)變化進(jìn)行檢測(cè),確定HP-NAP對(duì)荷載B16F10-TCL的DC成熟的影響。6.經(jīng)HP-NAP和B16F10-TCL處理DC細(xì)胞,與尼龍毛柱法純化得到的T細(xì)胞共培養(yǎng),MTT法檢測(cè)T細(xì)胞的增殖情況;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞表面早期活化Marker CD69的表達(dá)變化;ELISA檢測(cè)上清中IFN-γ及IL-17A的濃度;熒光定量PCR法檢測(cè)IL-4、IL-10在m RNA水平的變化。7.對(duì)C57BL/6小鼠進(jìn)行兩次200μg/只的B16F10-TCL的皮下注射,兩次注射之間間隔5天,第二次注射5或6天后取小鼠脾臟細(xì)胞,尼龍毛柱純化抗原特異性T細(xì)胞,與經(jīng)HP-NAP和B16F10-TCL處理的DC共培養(yǎng)后,熒光定量PCR法檢測(cè)顆粒酶及穿孔素在m RNA水平的變化;ELISA法檢測(cè)上清中IFN-γ的濃度;以其作為效應(yīng)細(xì)胞,與B16F10按照10:1,20:1,40:1的比例共培養(yǎng)6小時(shí),LDH法檢測(cè)T細(xì)胞的殺傷能力。結(jié)果1.表達(dá)純化的HP-NAP純度及濃度達(dá)到實(shí)驗(yàn)需求。2.誘導(dǎo)分化的DC純度85%以上,可以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。3.HP-NAP對(duì)DC的成熟有促進(jìn)作用,1μM為HP-NAP對(duì)DC發(fā)揮刺激作用的最適濃度,選擇該濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。4.HP-NAP刺激后,野生型C57BL/6小鼠來(lái)源的DC表面的CD80表達(dá)顯著上調(diào),而TLR2缺陷型C57BL/6小鼠來(lái)源的DC表面的CD80的表達(dá)無(wú)明顯改變。5.HP-NAP和B16F10-TCL處理后的DC表面共刺激分子CD80、CD86及趨化因子受體CCR7表達(dá)量顯著上升,抗原吞噬能力顯著下降;HP-NAP和B16F10-TCL處理后的DC表達(dá)細(xì)胞因子IL-12、IL-23、IL-1β的水平顯著上調(diào)。6.HP-NAP和B16F10-TCL處理后的DC刺激T細(xì)胞增殖和活化的能力顯著上升。HP-NAP和B16F10-TCL處理后的DC可以顯著上調(diào)T細(xì)胞表達(dá)IFN-γ。7.HP-NAP和B16F10-TCL處理后的DC能夠刺激抗原特異性的T細(xì)胞合成細(xì)胞毒作用效應(yīng)分子Granzyme B和Proforine,并顯著上調(diào)IFN-γ的表達(dá)。HP-NAP和B16F10-TCL處理后的DC誘導(dǎo)抗原特異性CTL的能力顯著增強(qiáng)。結(jié)論1.HP-NAP通過(guò)TLR2發(fā)揮對(duì)DC成熟的刺激作用。2.HP-NAP能夠促進(jìn)荷載B16F10-TCL的DC的成熟。3.HP-NAP處理的荷載B16F10-TCL的DC刺激T細(xì)胞增殖和活化的能力顯著增強(qiáng)并介導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答。4.HP-NAP顯著增強(qiáng)荷載B16F10-TCL的DC激發(fā)CTL的能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.5

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本文編號(hào)：2340851