【摘要】：研究背景及目的黑色素瘤是發(fā)生在皮膚組織的一種惡性腫瘤，黑色素瘤[LU1]對人類健康的危害性不斷增長[LU2]，在已發(fā)現(xiàn)[LU3]發(fā)生轉(zhuǎn)移的黑色素瘤患者中，平均存活時間只有6到10個月。發(fā)生轉(zhuǎn)移的黑色素瘤細胞具有非常[LU4]強大的增殖能力，并且對大多數(shù)的[LU5]腫瘤治療藥物均具有明顯的抗性[LU6]作用，因此導致對其的[LU7]治療效果非常不理想。這些治療方案包括多種已用于三期臨床試驗的方法，例如免疫治療，細胞因子治療，放射治療以及化學治療等。甚至是化學治[LU8]療試劑的聯(lián)合使用[LU9]療法在過去的20年中也沒有改變臨床試驗的生存率問題。 研究表明黑色素瘤對治療藥物的超強抵抗性作用和主要是與其自身多種細胞凋亡通路發(fā)生失活有關。研究表明這些治療方案包括多種已用于三期臨床試驗的方法，例如免疫治療，細胞因子治療，放射治療以及化學治療。甚至是化學治療試劑的聯(lián)合使用療法在過去的20年中也沒有改變臨床試驗的生存率問題。 黑色素瘤細胞對于藥物治療的高度耐受，因為黑色素瘤細胞[LU10]能夠很好地適應治療藥物形成的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激，并逃脫由其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[LU11]導致的凋亡，從而表現(xiàn)為高度耐受藥物治療。因此，研究黑色素瘤對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的適應機制顯得尤為重要。傳統(tǒng)的治療方法不能改善黑色素瘤的生存率問題，究其根本原因是人們對黑色素瘤中[LU12]細胞凋亡的具體機制缺乏了解，很多特異性的存活機制導致常規(guī)藥物治療完全失去效應。同時，近年來的報道也證明黑色素瘤具有很強的生存機制并參與了黑色素瘤對化療藥物的抵抗作用，。因此，研究黑色素瘤對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的適應機制顯得尤為重要。近年來的報道也證明了越來越多的生存機制參與了黑色素瘤對藥物的抗性作用中，關于這方面的研究也越來越受到人們的關注。在此基礎上，本項工作旨在研究黑色素瘤細胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激條件下的存活機制及其具體的信號通路，我們期望找到能夠成為黑色素瘤治療過程中有效的生物標志物的蛋白[LU13]，以期為黑色素瘤的臨床治療提供新的思路和藥物作用靶點。 方法（1）以黑色素瘤細胞Mel-RM為研究對象，用衣霉素(TM)處理構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的模型，，以對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激具有抗性的黑色素瘤細胞Mel-RM為研究對象，用衣霉素(TM)處理細胞，構(gòu)建內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的模型，然后通過mRNA芯片分析，尋找到對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激具有抗性的黑色素瘤細胞差異基因的表達基因survivin[LU14]；并采用QRT-PCR、Western Bloting驗證芯片結(jié)果，（2）根據(jù)芯片分析結(jié)果，同時檢測比較內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激情況下不同黑色素瘤細胞株中survivin的表達情況以及其他種類腫瘤中survivin的表達；（2）；并利用慢病毒系統(tǒng)篩選到survivin穩(wěn)定過[LU15]表達的Mel-RM細胞株，采用衣霉素處理后，利用Hoechst33342染核、MTT法分析細胞活力、Western Bloting檢測細胞凋亡的分子標志物等方法，來比較檢測survivin過表達的情況下黑色素瘤細胞對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激誘導凋亡抗性的變化情況；（3）黑色素瘤細胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時細胞周期阻滯于G1期，過表達survivin后通過流式細胞術(shù)檢測細胞周期的變化情況、及Western Bloting分別檢測細胞周期及檢測細胞周期相關蛋白的變化水平，觀察在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時，過表達survivin的黑色素瘤細胞的細胞周期變化情況；（4）采用生物信息學方法分析survivin的啟動子區(qū)域結(jié)構(gòu)及，發(fā)現(xiàn)潛在的轉(zhuǎn)錄因子E2F1的結(jié)合位點。通過熒光素酶實驗證實survivin的啟動子活性在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時被抑制，但外源實驗證實能夠被E2F1激活，采用RNA干擾方法降低E2F1的蛋白水平后survivin的變化消失。 結(jié)果（1）對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激具有抗性的黑色素瘤細胞在衣霉素處理時survivin的mRNA和蛋白水平下調(diào)，而且這種改變是黑色素瘤細胞所特有；（2）survivin的下調(diào)與黑色素瘤對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的抗性相關，而且外源過表達survivin后降低了黑色素瘤細胞對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的抗性；（3）survivin的下調(diào)是通過形成細胞周期阻滯來保護黑色素瘤細胞，從而表現(xiàn)為適應內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激；外源過表達survivin后，促進黑色素瘤細胞通過G1期阻滯，從而減弱黑色素瘤細胞對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的抗性；（4）survivin在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激情況下受E2F1轉(zhuǎn)錄調(diào)控。E2F1蛋白水平在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激時降低，從而減弱對于survivin的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。外源過表達E2F1同樣降低黑色素瘤細胞對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的抗性。 結(jié)論研究發(fā)現(xiàn)survivin的下調(diào)對于黑色素瘤細胞逃脫內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激引起的凋亡至關重要，穩(wěn)定過表達survivin的黑色素瘤細胞株對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的敏感性明顯增加。Survivin下調(diào)使黑色素瘤細胞能夠很好適應內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的具體機制是通過形成細胞周期阻滯實現(xiàn)的。而且我們發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的情況下survivin受轉(zhuǎn)錄因子E2F1轉(zhuǎn)錄調(diào)控，穩(wěn)定過表達野生型的E2F1同樣明顯增加黑色素瘤細胞對于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的敏感性。我們的研究結(jié)果證實了黑色素瘤細胞耐受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的機制中存在E2F1-survivin-cell cycle arrest這樣一條信號通路。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2012
【分類號】：R739.5

【共引文獻】

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本文編號：2267837