本文選題：HB-13 + P物質　； 參考：《蘭州大學》2010年碩士論文

【摘要】： 目的： (1)體外培養(yǎng)人永生化角質形成細胞(HaCaT細胞),以P物質刺激,為下一步研究小檗堿衍生物HB-13的抗炎機制提供體外細胞模型。 (2)確定小檗堿衍生物HB-13作用于角質形成細胞(HaCaT)的安全濃度。 (3)研究HB-13對HaCaT細胞分泌細胞因子白細胞介素10(IL-10)及干擾素-y (IFN-y)的影響,以期探討HB-13的抗炎機制。 方法： 第一部分使用DMEM/F12培養(yǎng)基體外培養(yǎng)人永生化角質形成細胞(HaCaT細胞獲贈于西京醫(yī)院皮膚科),于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育,顯微鏡下觀察細胞完全貼壁,生長良好時,加入不同藥物濃度(2.5、5、10、20、40、80μg/mL)的小檗堿衍生物HB-13作用于HaCaT細胞,采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)法確定HB-13作用于HaCaT細胞的安全濃度。 第二部分以P物質(1×10-8mol/L)刺激HaCaT細胞,應用ELISA法檢測不同時間點(12h、24h、48h)培養(yǎng)上清液中IL-10及IFN-y的含量,檢測體外細胞模型是否建立成功。 第三部分基于前期的準備和研究,以P物質刺激HaCaT細胞,加入安全濃度(分別為2.5、5、10μg/mL)的HB-13共孵育12、24、48h,應用ELISA法檢測不同時間點培養(yǎng)上清液中IL-10及IFN-y的含量；應用免疫細胞化學方法檢測細胞內IL-10及IFN-y蛋白的表達；同時收集細胞提取總RNA，，通過熒光定量PCR法檢測不同時間點細胞內IL-1OmRNA及IFN-y mRNA表達情況。以雷公藤內酯醇(T0)作為陽性對照。 實驗數據采用SPSS 11.5軟件進行統計分析。 結果： (1)人永生化角質形成細胞(HaCaT細胞)體外培養(yǎng)形態(tài)觀察結果：細胞呈圓形、橢圓形或梭型及不規(guī)則形狀,與有關文獻報道相一致； (2)HB-13濃度為2.5、5、10、20、40、80μg/mL時,吸光度值分別為0.982±0.041,0.980±0.043,0.979±0.042,0.728±0.052,0.564±0.053,0.323±0.053；無藥對照細胞組吸光度值為0.982±0.037；經統計學分析,HB-13濃度在2.5、5、10μg/mL時,吸光度值與正常組相比無統計學差異(p0.05)；HB-13濃度在20、40、80μg/mL時,吸光度值與正常組相比有統計學意義(p0.01)；提示HB-13濃度在20、40、80μg/mL時對HaCaT細胞有一定的毒性作用。因此,本研究選擇2.5、5、10μg/mL為HB-13的安全濃度； (3)以P物質刺激HaCaT細胞,分別加入2.5、5、10μg/mL的HB-13共孵育12、24、48h,HB-13可促進P物質誘導的IL-10的分泌。與對照組雷公藤內酯醇(T0)相比,2.5μg/mL的HB-13在12、24h時其促進IL-10分泌水平低于To(p0.05)；隨著HB-13濃度增加(5.10μg/mL)及時間的延長,其促進IL-10分泌水平明顯高于T0(p0.01)。各組間相比亦有顯著性差異(p0.05)。ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中IL-10蛋白的表達水平及熒光定量PCR法檢測IL-10mRNA水平其變化結果相一致；免疫細胞化學示IL-10的在HaCaT細胞的胞漿中表達,其變化水平與上述檢測水平結果相一致； (4)細胞經P物質刺激后,分別加入2.5、5、10μg/mL的HB-13共孵育12、24、48h，HB-13可促進P物質誘導的IFN-γ的分泌。與對照組雷公藤內酯醇(T0)相比,HB-13促進IFN-γ分泌的作用更強(p0.01),但無藥物濃度和作用時間的差異(p0.05)。ELISA法檢測培養(yǎng)上清液中IFN-γ蛋白的表達水平及熒光定量PCR法檢測IFN-ymRNA水平其變化結果相一致；免疫細胞化學示IFN-γ的在HaCaT細胞的胞漿中表達,其變化水平與上述檢測水平結果相一致。結論： (1)濃度為2.5、5、10μg/mL的小檗堿衍生物HB-13是作用于HaCaT細胞的安全濃度； (2)HB-13的抗炎作用部分可能是通過促進細胞因子IL-10及IFN-γ的分泌而實現的。
[Abstract]:Objective:
(1) the human immortalized keratinocytes (HaCaT cells) were cultured in vitro, which was stimulated by substance P to provide an in vitro cell model for the study of the anti-inflammatory mechanism of berberine derivative HB-13.
(2) determine the safe concentration of berberine derivative HB-13 acting on keratinocytes (HaCaT).
(3) to study the effect of HB-13 on the secretion of cytokines, interleukin 10 (IL-10) and interferon -y (IFN-y) in HaCaT cells, in order to explore the anti-inflammatory mechanism of HB-13.
Method錛

本文編號：1829002