發(fā)布時(shí)間：2018-04-06 22:25

  本文選題：重癥藥疹　切入點(diǎn)：藥物特異性T細(xì)胞　出處：《第四軍醫(yī)大學(xué)》2010年碩士論文

【摘要】： 藥疹是一種由藥物引起的不良反應(yīng)。藥物通過口服、注射或吸入等途徑,進(jìn)入人體內(nèi)而引發(fā)的皮膚或粘膜的炎癥性損害。重癥藥疹是皮膚科常見急癥,其種類繁多,Stevens- Johnson綜合征(Stevens-Johnson Syndrome;SJS)、大皰性表皮壞死松解型藥疹(Toxic Epidermal Necrolysis;TEN)是其中最嚴(yán)重的兩種類型,其病情變化快,皮疹廣泛,常伴有高熱,嚴(yán)重者會(huì)出現(xiàn)全身癥狀及肝腎功能紊亂,此外還伴有大面積表皮內(nèi)大皰,以及皮膚和粘膜的剝脫,具有較高的死亡率。 藥疹的發(fā)病機(jī)制尚不明確,近年來,越來越多的研究發(fā)現(xiàn)重癥藥疹的發(fā)病與免疫學(xué)機(jī)制有密切的關(guān)系。在對(duì)重癥藥疹的研究中,國(guó)外相繼發(fā)現(xiàn):①SJS與TEN患者在首次發(fā)生藥物過敏反應(yīng)之后,再次接觸致敏藥物反應(yīng)更迅速,也更強(qiáng)烈,對(duì)患者機(jī)體的損傷也更為嚴(yán)重;②HLA基因在決定患者是否罹患重癥藥疹具有重要作用,HLA-B*1502與卡馬西平、HLA-B*5801與別嘌呤醇導(dǎo)致的重癥藥疹相關(guān);③重癥藥疹患者皮損、水皰內(nèi)含有HLA限制性、具有細(xì)胞毒活性的CD8+ T淋巴細(xì)胞;④應(yīng)用藥物及其衍生物,可從患者外周血單核細(xì)胞(peripheral blood monouclear cells;PBMC)中培養(yǎng)獲得藥物特異性T細(xì)胞株和T細(xì)胞克隆。上述結(jié)果證實(shí)免疫學(xué)機(jī)制在SJS、TEN發(fā)病中具有關(guān)鍵作用。 大多數(shù)發(fā)疹型藥疹的發(fā)病與細(xì)胞免疫密切相關(guān),屬于Th1反應(yīng)優(yōu)勢(shì),IFN-γ是Th1途徑釋放出的主要因子,重癥藥疹也不例外,患者外周血T細(xì)胞,受到致敏藥物刺激后,Th1釋放IFN-γ增加。 Fas系統(tǒng)包括Fas、FasL、可溶性FasL。FasL與Fas結(jié)合后能誘導(dǎo)表達(dá)Fas的細(xì)胞凋亡;Fas及其配體FasL是近年來研究得最為深入的有關(guān)細(xì)胞凋亡的膜表面分子。有學(xué)者通過FasL激活Fas是導(dǎo)致TEN患者表皮細(xì)胞凋亡的第一步。在所有SJS、TEN患者血清內(nèi)的sFasL濃度是明顯升高的,而多形紅斑型藥疹及正常人中sFasL沒有明顯升高。但SJS、TEN之間sFasL并沒有顯著差異。臨床發(fā)病過程分析表明,SJS、TEN患者血清內(nèi)的sFasL,會(huì)隨著時(shí)間增加而逐漸減少。 在重癥藥疹發(fā)病過程中,有些病人在發(fā)病過程中會(huì)產(chǎn)生大小不一的松弛型水皰、大皰,受外力后可形成糜爛面,皮損免疫病理顯示表皮內(nèi)以CD8+細(xì)胞占優(yōu)勢(shì),而真皮內(nèi)細(xì)胞浸潤(rùn)則以CD4+細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)。 因此我們決定以T細(xì)胞功能為研究對(duì)象,通過觀察T細(xì)胞功能與藥物刺激的關(guān)系,體外檢測(cè)IFN-γ、sFasL分泌水平,不僅可以證明經(jīng)致敏藥物刺激后的T細(xì)胞可分泌炎癥因子,從而引起了表皮細(xì)胞的損傷;也將有可能應(yīng)用于臨床上重癥藥疹患者致敏藥物的鑒定研究,為臨床醫(yī)師提供可靠的患者致敏藥物判定依據(jù)。 目的: 以重癥藥疹患者藥物特異性T細(xì)胞的細(xì)胞因子及細(xì)胞毒蛋白為研究對(duì)象,研究重癥藥疹藥物致敏及損傷表皮的機(jī)制,為建立體外致敏藥物檢測(cè)方法和開展重癥藥疹的臨床救治工作打下基礎(chǔ)。 方法: 共收集10例重癥藥疹患者(住院患者和治愈后門診隨訪患者),抽取患者外周血分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC),經(jīng)相應(yīng)的致敏藥物刺激后培養(yǎng)出T細(xì)胞株,用ex vivo ELISPOT和Cultured ELISPOT的方法檢測(cè)患者PBMC及藥物特異性T細(xì)胞株分泌干擾素-γ(interferon-γ;IFN-γ)的情況。對(duì)10例患者同時(shí)設(shè)立與致敏藥物分子結(jié)構(gòu)不同的無(wú)關(guān)藥物對(duì)照組。 將經(jīng)致敏藥物刺激后藥物刺激孔上清與HaCaT細(xì)胞共培養(yǎng)18h。用光鏡、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀檢測(cè)HaCaT細(xì)胞凋亡的情況;以及用ELISA的方法,觀察重癥藥疹患者藥物特異性T細(xì)胞株上清液中sFasL含量。其中重癥藥疹患者與正常人各10例;經(jīng)檢驗(yàn),其流行病學(xué)特征與總體樣本無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;二組年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05),具有可比性。 結(jié)果: 10例重癥藥疹患者PBMC經(jīng)致敏藥物刺激后IFN-γ的分泌均明顯高于對(duì)照藥物組、正常人對(duì)照組及其他類型藥疹組(P0.001)。10例其他類型藥疹中有四例患者PBMC經(jīng)致敏藥物刺激后IFN-γ的分泌較對(duì)照藥物及正常人對(duì)照組均略有升高(P0.05)。另外IFN-γ的分泌會(huì)隨著與致敏藥物共培養(yǎng)天數(shù)的增加而增多。 使用相應(yīng)致敏藥物培養(yǎng)出藥物特異性的T細(xì)胞株,并采用ELISPOT的方法觀察后發(fā)現(xiàn),藥物特異性T細(xì)胞株經(jīng)致敏藥物刺激后IFN-γ的分泌明顯高于正常人對(duì)照及非重癥藥疹組(P0.001)。10例其他類型藥疹中有四例患者T細(xì)胞株經(jīng)致敏藥物刺激后IFN-γ的分泌較對(duì)照藥物組及正常人對(duì)照組有所升高(P0.05)。SNK-q檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示,PBMC、T細(xì)胞株兩組間IFN-γ的分泌有顯著差異(P0.05),經(jīng)藥物刺激后的T細(xì)胞株IFN-γ的分泌水平高于PBMC組。 為證明藥物特異性T細(xì)胞在患者體內(nèi)長(zhǎng)期存在,我們?cè)?0例患者中尋找到3例病史為1-3年的患者,同樣發(fā)現(xiàn)其PBMC及T細(xì)胞株中均存在藥物特異性T細(xì)胞株。 另外,用光鏡、熒光顯微鏡、流式細(xì)胞儀檢測(cè)中均可以看到加入2%藥物刺激孔上清組,HaCat凋亡明顯多于1%藥物刺激孔上清組;而加入抗FasL的抗體anti-FasL mAb(1μg/mL)后,HaCat細(xì)胞凋亡減少。并且,重癥藥疹患者藥物特異性T細(xì)胞株上清液中sFasL含量,明顯高于正常人對(duì)照組(P0.01)。 結(jié)論: 重癥藥疹患者體內(nèi)存在著藥物特異性T細(xì)胞。ex vivo ELISPOT聯(lián)合Cultured ELISPOT方法在體外檢測(cè)患者PBMC、T細(xì)胞株經(jīng)致敏藥物刺激后產(chǎn)生IFN-γ的分泌水平,可能有助于致敏藥物的鑒定。藥疹患者治愈后體內(nèi)持續(xù)存在藥物特異性的T細(xì)胞,這提示患者應(yīng)嚴(yán)格避免致敏藥物是的再次服用。 外周血中單個(gè)核細(xì)胞分泌大量死亡受體的配體sFasL與角質(zhì)細(xì)胞中的Fas相結(jié)合,從而導(dǎo)致角質(zhì)形成細(xì)胞的凋亡;而阻斷sFasL后角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡明顯減少,從而說明角質(zhì)形成細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。
[Abstract]:Drug eruption is a drug - induced adverse reaction . Drugs enter into human body through oral , injection or inhalation route . Severe drug eruption is one of the most serious types . Stevens - Johnson Syndrome ( SJS ) , bullous epidermal necrolysis type ( Stevens - Johnson Syndrome ; SJS ) , bullous epidermal necrolysis type ( SJS ) , bullous epidermal necrolysis type ( SJS ) , bullous epidermal necrolysis type ( SJS ) , bullous epidermal necrolysis type ( SJS ) , bullous epidermal necrolysis type drug eruption ( TEN ) are the most serious types , with severe symptoms and disorder of liver and kidney function .



The pathogenesis of drug eruption is not clear . In recent years , more and more studies have found that the pathogenesis of severe drug eruption is closely related to immunological mechanism .



Most of the rash type drug eruption is closely related to cellular immunity , which belongs to Th1 response advantage . IFN - 緯 is the main factor released by Th1 pathway , and the severe drug eruption is not the exception , and the peripheral blood T cell of the patient is stimulated by the sensitizing drug , and the Th1 release IFN - 緯 increases .



The expression of Fas , FasL , soluble FasL , FasL and Fas combined with Fas could induce the apoptosis of apoptotic cells . Fas and FasL were the first step in the study of apoptosis in TEN patients . The expression of sFasL in serum of all SJS and TEN patients was significantly higher than that in normal controls . However , the sFasL levels in serum of SJS and TEN were not significantly different .



In the course of the onset of severe drug eruption , some patients may develop a loose blister or blister during the course of the disease , which can form erosion surface after external force , and the immune and pathological changes of skin lesions show that CD8 + cells are dominant in the epidermis , while the infiltration of the cells in the dermis is dominated by CD4 + cells .



Therefore , we decided to study the relationship between T cell function and drug stimulation by observing the relationship between T cell function and drug stimulation , and detect the secretion of IFN - 緯 and sFasL in vitro .



Purpose :



In order to establish an in vitro drug - sensitive drug detection method and to carry out the clinical treatment of severe drug eruption , we study the mechanism of drug - specific T - cell and cytotoxic protein of drug - specific T cell in severe drug eruption .



Method :



A total of 10 patients with severe drug eruption ( hospitalized patients and post - cured outpatient follow - up patients ) were collected , and mononuclear cells ( PBMC ) were isolated from peripheral blood of patients . T cell lines were cultured after stimulation with corresponding sensitizing drugs , and IFN - 緯 ( IFN - 緯 ) secretion of PBMC and drug - specific T cell lines was detected by ex vivo ELISA .



The levels of sFasL in the supernatant of drug - specific T cell lines in patients with severe drug eruption were examined by light microscopy , fluorescence microscope and flow cytometry , and the levels of sFasL in the supernatant of drug - specific T cell lines were observed by ELISA .



Results :



IFN - 緯 secretion in PBMCs of 10 patients with severe drug eruption was significantly higher than that of control drug group , normal control group and other types of drug eruption group ( P0.001 ) . The secretion of IFN - 緯 increased slightly in four patients with other types of drug eruption ( P0.05 ) .



The secretion of IFN - 緯 was significantly higher than that of control group and non - serious drug eruption group ( P0.05 ) .



In order to demonstrate the long - term presence of drug - specific T cells in patients , we found 3 patients with a history of 1 - 3 years in 10 patients , and also found that there were drug - specific T cell lines in both PBMC and T cell lines .



In addition , the apoptosis of HaCat cells was significantly higher than that of normal controls ( P0.01 ) .



Conclusion :



In patients with severe drug eruption , there is a drug - specific T - cell in the body of patients with severe drug eruption .



The ligand sFasL secreting a large number of death receptors in peripheral blood is combined with Fas in keratinocytes , which leads to the apoptosis of keratinocytes . The apoptosis of keratinocytes after blocking the sFasL is significantly reduced , which indicates that the keratinocytes play an important role in the process of apoptosis .

【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R758.25

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本文編號(hào)：1719190